nNOS在小鼠心肌缺血再灌注損傷和缺血預(yù)處理中的作用機(jī)制研究.pdf

1、前言：
　　心肌梗死是當(dāng)今世界最常見(jiàn)的心血管事件之一，治療時(shí)恢復(fù)血流灌注卻可能因?yàn)榛钚匝醯漠a(chǎn)生等而導(dǎo)致缺血再灌注損傷。一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)可通過(guò)催化產(chǎn)生NO而促進(jìn)血小板和中性粒細(xì)胞粘附聚集;調(diào)節(jié)冠狀動(dòng)脈血流;并在心跳節(jié)律和心肌收縮性方面發(fā)揮重要的作用。目前認(rèn)為，NOS可分為三種類型:誘導(dǎo)型NOS(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)、內(nèi)皮型NOS(

2、Endothelialnitric oxide synthase，eNOS)和神經(jīng)元型NOS(Neuronal nitric oxide synthase,nNOS)。
　　NOS在缺血再灌注損傷（Ischemia reperfusion injury，IRI）中的作用目前頗有爭(zhēng)議。大部分?jǐn)?shù)據(jù)顯示NOS在缺血再灌注損傷中起保護(hù)作用。通過(guò)藥物抑制或者基因敲除的辦法去除iNOS或者eNOS能加重心肌缺血再灌注損傷。與此相反，另一些實(shí)驗(yàn)

3、卻發(fā)現(xiàn)去除iNOS或eNOS對(duì)心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。研究顯示活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，如超氧陰離子和過(guò)氧亞硝酸根離子在調(diào)節(jié)心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮了重要作用。許多研究證明NOS激活可增加過(guò)氧亞硝酸根離子產(chǎn)量，過(guò)氧亞硝酸根離子是NO和超氧陰離子反應(yīng)產(chǎn)生的，這可能是NO導(dǎo)致心肌缺血再灌注損傷的主要原因。有證據(jù)證明:nNOS在調(diào)節(jié)心臟心率，鈣循環(huán)，鈉轉(zhuǎn)運(yùn)和能量代謝等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，然而其在心肌

4、缺血再灌注損傷中的作用不甚明了。離體心臟缺血再灌注實(shí)驗(yàn)顯示，野生型和nNOS-/-小鼠心肌梗死面積無(wú)顯著差異，但是在nNOS-/-組心肌梗死面積有減小趨勢(shì)(33％vs30％，p＞0.05)。
　　有關(guān)NOS在心臟缺血預(yù)處理(Ischemic preconditioning，IP)中的作用，分為兩個(gè)不同的階段:在2-3小時(shí)的快速發(fā)展階段，和12-24小時(shí)后，甚至72小時(shí)的延遲期，主要起保護(hù)作用。Bolli等發(fā)現(xiàn)NOS的兩種亞型iNO

5、S和eNOS產(chǎn)生的NO在IP的延遲期發(fā)揮保護(hù)作用。最近的研究也發(fā)現(xiàn)，在兔IP的延遲期的終末階段，nNOS與還氧化酶-2共同作用發(fā)揮保護(hù)作用。然而，nNOS是否參與早期IP仍有爭(zhēng)議。
　　盡管nNOS在調(diào)節(jié)心臟功能方面發(fā)揮重要作用，然其在心肌缺血再灌注損傷中的作用和在早期IP時(shí)對(duì)心臟的作用還不明晰。因而本研究我們主要通過(guò)觀察nNOS基因敲除小鼠，nNOS抑制劑和自由基清除劑對(duì)小鼠心肌缺血再灌注損傷和缺血預(yù)處理的影響，觀察nNOS在心

6、臟缺血再灌注和缺血預(yù)處理時(shí)的作用，為深入研究nNOS在心肌缺血性疾病中的作用機(jī)制提供重要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　材料和方法：
　　一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組
　　12周齡nNOS KO鼠和C57BL/6小鼠(wild type，WT)由日本香川大學(xué)醫(yī)學(xué)部和中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。實(shí)驗(yàn)分為野生型假手術(shù)組(WT SHAM)，野生型缺血再灌注組(WT IR)，野生型缺血再灌注L-VNIO處理組(WT IR+L-VNIO)，野生型

7、缺血再灌注MnTBAP處理組(WT IR+ MnTBAP)，nNOS基因敲除鼠假手術(shù)組(KO SHAM)，nNOS基因敲除鼠缺血再灌注組(KO IR)，nNOS基因敲除鼠缺血再灌注MnTBAP處理組(KO IR+ MnTBAP)，野生型缺血預(yù)處理組(WT IP)，野生型缺血預(yù)處理L-VNIO處理組(WT IP+ L-VNIO)，nNOS基因敲除鼠缺血預(yù)處理組(KO IP)。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　　（一）小鼠心肌缺血再灌注損傷

8、模型制備
　　小鼠心肌缺血再灌注損傷模型按照文獻(xiàn)記載的方法并進(jìn)行修改，簡(jiǎn)言之，動(dòng)物由苯巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，呼吸機(jī)輔助呼吸。在手術(shù)前30min，通過(guò)頸靜脈輸注分別給予nNOS抑制劑，亞胺基烯丁基-L-鳥(niǎo)氨酸（L-VNIO，60μg/kg）和超氧化物歧化酶模擬物即過(guò)氧化物清除劑錳苯甲酸卟啉(MnTBAP，1 mg/kg)。打開(kāi)左前胸，暴露心臟，用7/0尼龍絲線在左心耳下方2 mm處結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，解剖顯微鏡

9、下確認(rèn)，結(jié)扎30 min再松開(kāi)恢復(fù)再灌流3h。假手術(shù)組打開(kāi)胸腔暴露心臟，而不結(jié)扎動(dòng)脈。預(yù)處理組在缺血30 min實(shí)驗(yàn)前分別進(jìn)行缺血5 min再灌注5 min共三個(gè)循環(huán)的預(yù)處理，實(shí)驗(yàn)前和再灌注后24 h，尾部套管法監(jiān)測(cè)清醒狀態(tài)下小鼠的心率和血壓。
　?。ǘ┬募」Ｋ烂娣e的測(cè)定
　　在再灌注結(jié)束后，按照文獻(xiàn)介紹的方法計(jì)算梗死面積/缺血危險(xiǎn)區(qū)的比值。簡(jiǎn)而言之，再灌注后取下心臟，從主動(dòng)脈灌注熒光聚合物溶液。在紫外光下確定缺血危險(xiǎn)區(qū)（

10、熒光區(qū)）。然后切片在2％2，3，5三苯基氯化氮唑(TTC)溶液中37℃孵育25分鐘。梗死區(qū)為白色區(qū)域，非梗死區(qū)組織染成磚紅色。通過(guò)NIH Image1.0軟件測(cè)定分析缺血危險(xiǎn)區(qū)和梗死區(qū)面積大小，并計(jì)算梗死面積/缺血危險(xiǎn)區(qū)的比值。
　?。ㄈ┬募〖?xì)胞凋亡的測(cè)定
　　OCT包裹組織制成4μm冰凍切片并按TUNEL試劑盒要求進(jìn)行染色。染色后用熒光顯微鏡觀察結(jié)果。每個(gè)標(biāo)本取三片，每片測(cè)定十個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域計(jì)數(shù)細(xì)胞核的數(shù)量以及TUNE

11、L陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，并計(jì)算TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量占細(xì)胞核的比值。caspase-3，8，9活性根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。數(shù)據(jù)用單位每μg蛋白表示。Bax，Bcl-2和Fas蛋白的表達(dá)用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。
　?。ㄋ模┬呐K脂質(zhì)過(guò)氧化的測(cè)定
　　取左心室缺血區(qū)組織，按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法檢測(cè)硫代巴比妥反應(yīng)物質(zhì)(TBARS)的水平。簡(jiǎn)而言之，組織用含0.15 mol/L KCI和0.02 mol/L Tris-HCI(pH7.

12、4)的緩沖液制成5％（重量/體積）勻漿。勻漿液與15％三氯乙酸和0.375％硫代巴比妥酸混合。反應(yīng)物中加入0.01％二叔丁基對(duì)甲酚以防止樣品自氧化，混合物100℃加熱15分鐘。冷卻后，將混合物在3500轉(zhuǎn)離心20分鐘，在535 nm處測(cè)定有機(jī)相的吸光度，數(shù)據(jù)用nmol每毫克組織表示。
　　（五）硝基酪氨酸表達(dá)水平測(cè)定
　　蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定組織蛋白含量。等量的蛋白(50 ug)進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳畢轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素

13、膜上硝基酪氨酸一抗孵育，4℃過(guò)夜。 HRP-二抗孵育1小時(shí)后顯色系統(tǒng)顯色。膜脫抗體處理后再用β-actin抗體孵育。Western blot條帶用NIHImage software分析灰度。
　　結(jié)果：
　　一、一般狀況
　　在所有的野生型小鼠，體重和心臟重量無(wú)顯著差異。年齡匹配的nNOS基因敲除小鼠與野生型小鼠相比，體重和心臟重量較輕(p＜0.05)。在清醒的狀態(tài)下，手術(shù)前后收縮壓、舒張壓和心率都沒(méi)有顯著差異。L-V

14、NIO或MnTBAP給藥預(yù)處理后收縮壓，舒張壓和心率與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。
　　二、心肌缺血再灌注對(duì)心肌梗死面積的影響
　　在野生型小鼠，與WT SHAM組相比， WTIR組小鼠平均梗死面積與缺血危險(xiǎn)區(qū)百分比顯著增高(p＜0.05)。與WTIR組相比，L-VNIO預(yù)處理后比值顯著降低(p＜0.05)，與WTIR組和WTIR+L-VNIO組相比，MnTBAP預(yù)處理組比值進(jìn)一步降低(p＜0.05)。
　　在nNOS基因敲

15、除鼠，KOSHAM組平均梗死面積與缺血危險(xiǎn)區(qū)百分比與WTSHAM組相比沒(méi)有明顯差異。與KOSHAM組相比，KOIR組平均梗死面積與缺血危險(xiǎn)區(qū)百分比顯著增高(p＜0.05)，與WTIR組相比，KOIR組平均梗死面積與缺血危險(xiǎn)區(qū)百分比顯著降低(p＜0.05)。與KOIR組相比，MnTBAP預(yù)處理組比值進(jìn)一步降低(p＜0.05)。
　　三、心肌缺血再灌注對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響
　　心肌細(xì)胞凋亡用TUNEL染色和caspase-3，8

16、，9的活性以及凋亡蛋白Bax，Bcl-2和Fas的表達(dá)進(jìn)行評(píng)價(jià)。在野生型小鼠，與WT SHAM組相比， WT IR組小鼠TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞平均百分比和caspase-3，8，9活性以及Bax和Fas蛋白表達(dá)顯著增加，Bcl-2表達(dá)顯著降低(p＜0.05)。與WT IR組相比，L-VNIO預(yù)處理后TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞平均百分比和caspase-3，8，9活性，Bax和Fas蛋白表達(dá)顯著降低，Bcl-2表達(dá)顯著增加(p＜0.05)，與WT I

17、R組和WT IR+L-VNIO組相比，MnTBAP預(yù)處理組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞平均百分比和caspase-3，8，9活性以及Bax和Fas蛋白表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)顯著增加(p＜0.05)。
　　在nNOS基因敲除鼠，KOSHAM組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞平均百分比和caspase-3，8，9活性以及Bax，Bcl-2和Fas的表達(dá)與WTSHAM組相比沒(méi)有明顯差異。與KOSHAM組相比，KOIR組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞平均百分比和caspa

18、se-3，8，9活性以及Bax和Fas蛋白表達(dá)顯著增加，Bcl-2表達(dá)顯著降低(p＜0.05)，與WTIR組相比，KOIR組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞平均百分比和caspase-3，8，9活性以及Bax和Fas蛋白表達(dá)顯著降低，Bcl-2表達(dá)顯著增加(p＜0.05)。與KOIR組相比，MnTBAP預(yù)處理組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞平均百分比和caspase-3，8，9活性以及Bax和Fas蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低，Bcl-2表達(dá)顯著增加(p＜0.05）。

19、r>　　四、心肌缺血再灌注對(duì)TBARS和酪氨酸硝基化的影響
　　在野生型小鼠，與WTSHAM組相比，WTIR組小鼠心臟TBARS含量和硝基酪氨酸表達(dá)明顯增加(p＜0.05)。與WTIR組相比，L-VNIO和MnTBAP預(yù)處理后相應(yīng)指標(biāo)顯著降低(p＜0.05)。
　　在nNOS基因敲除鼠，與WT SHAM組相比，KO SHAM組心臟TBARS含量和硝基酪氨酸表達(dá)增高(p＜0.05)。KO IR組心臟TBARS含量和硝基酪氨酸表

20、達(dá)與KO SHAM組相比無(wú)明顯差異，與KOIR組相比，MnTBAP預(yù)處理組數(shù)值顯著降低(p＜0.05)。
　　五、心肌缺血預(yù)處理對(duì)心肌梗死面積的影響
　　在野生型小鼠，與WTIR組相比，WTIP組小鼠平均梗死面積與缺血危險(xiǎn)區(qū)百分比明顯降低(p＜0.05)。與WT IP組相比，L-VNIO預(yù)處理后比值顯著增加(p＜0.05)。
　　在nNOS基因敲除鼠，與KOIR組相比，缺血預(yù)處理組沒(méi)有降低平均梗死面積與缺血危險(xiǎn)區(qū)百分比

21、。
　　六、心肌缺血預(yù)處理對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響
　　在野生型小鼠，與WTIR組相比，WTIP組小鼠TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞平均百分比和caspase-3，8，9活性以及Bax和Fas蛋白表達(dá)顯著降低，Bcl-2表達(dá)顯著增加(p＜0.05)。與WT IP組相比，L-VNIO預(yù)處理后TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞平均百分比和caspase-3，8，9活性以及Bax和Fas蛋白表達(dá)顯著增加，Bcl-2表達(dá)顯著降低(p＜0.05)。
　　在nN

22、OS基因敲除鼠，與KO IR組相比，缺血預(yù)處理組沒(méi)有降低心肌細(xì)胞凋亡程度。
　　七、心肌缺血預(yù)處理對(duì)TBARS及硝基酪氨酸水平的影響
　　在野生型小鼠，與WTIR組相比，WTIP組小鼠TBARS含量和硝基酪氨酸表達(dá)明顯降低(p＜0.05)。與WTIP組相比，L-VNIO預(yù)處理后數(shù)值顯著增加(p＜0.05)。
　　在nNOS基因敲除鼠，與KOIR組相比，缺血預(yù)處理組沒(méi)有降低TBARS含量和硝基酪氨酸表達(dá)。
　　結(jié)論