心肌組織氧代謝在小鼠急性心肌缺血再灌注損傷中的作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、第一部分
　　 背景及目的：
　　 目前，心肌缺血性疾病的患病率和致死率依然非常顯著。血流再灌注心肌時(shí)可防止心肌進(jìn)一步梗死面積擴(kuò)大，然而經(jīng)過較長時(shí)間的缺血后心肌再灌注也會給帶來逆轉(zhuǎn)的損傷，這一現(xiàn)象稱為缺血再灌注損傷。防治再灌注引起的心肌損傷成為心血管研究重點(diǎn)之一。冠狀動脈多次短暫的缺血可以是心肌對隨后而來較長時(shí)間的缺血耐受性增強(qiáng)，稱為缺血預(yù)適應(yīng)，能有效地保護(hù)心肌減少缺血再灌注損傷。缺血預(yù)適應(yīng)分為早期保護(hù)和延遲保護(hù)兩個(gè)時(shí)相

2、，而延遲相保護(hù)出現(xiàn)較晚但保護(hù)時(shí)間較長，成為研究熱點(diǎn)。眾多延遲相缺血預(yù)適應(yīng)保護(hù)機(jī)制得到研究闡明，然而對于其在缺血再灌注損傷中氧代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制不甚明了。我們前期對缺血再灌注小鼠模型研究實(shí)驗(yàn)中，利用電子順磁共振監(jiān)測心肌內(nèi)氧含量變化及激光多普勒血流監(jiān)測儀監(jiān)測心肌血流灌注分析發(fā)現(xiàn)心肌再灌注后產(chǎn)生超過缺血前基線Po2的高氧狀態(tài)。而內(nèi)皮誘導(dǎo)產(chǎn)生的一氧化氮及其衍生物調(diào)節(jié)線粒體呼吸鏈酶從而抑制線粒體氧消耗是其產(chǎn)生的重要機(jī)制之一。在本次實(shí)驗(yàn)中，我們將探明在

3、小鼠心肌缺血再灌注模型中，延遲相缺血預(yù)適應(yīng)是否通過調(diào)節(jié)線粒體呼吸鏈酶從而保護(hù)線粒體功能而改善缺血后心肌的高氧狀態(tài)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 建立C57小鼠心肌缺血再灌注模型。給予冠狀動脈左前降支30min缺血，60min再灌注。所有動物隨機(jī)分為四組（每組6只）：（1）假手術(shù)組：開胸，不結(jié)扎干預(yù)；（2）延遲相缺血預(yù)適應(yīng)組：反復(fù)結(jié)扎開放前降支3次，每次缺血5min，再灌注5min，24h后開胸假手術(shù)，不做缺血再灌注處理；（3

4、）缺血再灌注組：左前降支結(jié)扎缺血30min，再灌60min；（4）延遲相缺血預(yù)適應(yīng)治療組：反復(fù)結(jié)扎開放前降支3次，每次缺血5min，再灌注5min，24h后開胸左前降支缺血30min，再灌60min。
　　 在缺血前，缺血中，及再灌注中利用電子順磁共振儀監(jiān)測心肌組織氧含量，利用激光多普勒血流監(jiān)測儀監(jiān)測心肌組織血流灌注情況；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，測量心肌缺血面積及梗死面積，檢測心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性及蛋白表達(dá)水平，檢測SODs蛋白表達(dá)水

5、平；最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)論：
　　 延遲相缺血預(yù)適應(yīng)能通過上調(diào)Mn-SOD表達(dá)及線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性和蛋白表達(dá)來增加線粒體對缺血再灌注損傷的耐受性，從而抑制心肌灌注的高氧狀態(tài)，保護(hù)心肌細(xì)胞，減少梗死面積。
　　 缺血再灌注損傷；延遲相缺血預(yù)適應(yīng)；線粒體；電子順磁共振；活性氧第二部分背景及目的：
　　 隨著各種血流再灌注心肌的治療方案的廣泛應(yīng)用，心肌梗塞進(jìn)入再灌注時(shí)代，而隨之產(chǎn)生的再灌注損傷的防

6、治也成為研究熱點(diǎn)。在長時(shí)間缺血后，血流再灌注前多次反復(fù)短時(shí)的缺血再灌注處理可有效降低缺血再灌注損傷，這一現(xiàn)象稱為缺血后處理（IPOC）。由于缺血發(fā)生的時(shí)間的不確定性，缺血后處理與缺血預(yù)適應(yīng)（IPC）相比有著更為廣闊的臨床應(yīng)用前景。然而，研究表明，心肌缺血后梗死的嚴(yán)重程度與缺血的時(shí)間成正相關(guān)，而IPOC的保護(hù)效應(yīng)在不同的缺血時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)不同。當(dāng)缺血時(shí)間過短或者過長，IPOC的保護(hù)效果都不明顯。因此我們研究目的旨在揭示不同缺血時(shí)間條件下，從血

7、流灌注量及心肌細(xì)胞線粒體功能方面研究血管和心肌細(xì)胞損傷情況及IPOC的保護(hù)機(jī)制，從而確定IPOC對缺血心臟保護(hù)作用的時(shí)間窗并闡明影響確定保護(hù)作用時(shí)間窗的相關(guān)機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 野生型C57BL/6小鼠隨機(jī)分為九組。（1）假手術(shù)組；（2）15分鐘缺血再灌注組；（3）15分鐘缺血后處理組；（4）30分鐘缺血再灌注組；
　　 （5）30分鐘缺血后處理組；（6）45分鐘缺血再灌注組；（7）45分鐘缺血后處理組

8、；（8）60分鐘缺血再灌注組；（9）60分鐘缺血后處理組。假手術(shù)組開胸，不做干預(yù)。缺血再灌注模型組給予冠狀動脈左前降支結(jié)扎相應(yīng)時(shí)間造成缺血，再開放灌注60分鐘。缺血后處理模型組給予冠狀動脈左前降支結(jié)扎相應(yīng)時(shí)間造成缺血，隨后反復(fù)結(jié)扎開放左前降支10秒缺血/10秒再灌注循環(huán)，一共3次，之后再開放灌注60分鐘。體內(nèi)組織氧分壓采用電子順磁共振法（EPR）測量。局部血流量采用激光多普勒血流探測技術(shù)測定。再灌60分鐘后取缺血危險(xiǎn)區(qū)心肌組織標(biāo)本用于測

9、定線粒體復(fù)合體酶（還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶（NADH-DH），琥珀酸-細(xì)胞色素C 還原酶（SCR）以及細(xì)胞色素C 氧化酶（CcO））活性及eNOS蛋白表達(dá)。再灌后24小時(shí)后取心臟行TTC 染色用于梗死面積測定。
　　 結(jié)論：
　　 小鼠心肌缺血后處理對缺血再灌注損傷心臟的保護(hù)作用具有時(shí)間窗效應(yīng)。其對缺血心肌可保護(hù)的缺血時(shí)間窗是30分鐘至45分鐘缺血時(shí)間。而提高局部血流量和提高心肌細(xì)胞線粒體呼吸鏈耗氧產(chǎn)能功能是決定

10、可保護(hù)缺血時(shí)間窗的重要機(jī)制。缺血再灌注損傷，缺血后處理，電子順磁共振，局部血流量，線粒體第三部分背景及目的：
　　 急性心肌梗死經(jīng)過各種再灌恢復(fù)血供的治療抑制了梗死進(jìn)一步擴(kuò)大，同時(shí)也造成了新的損傷-再灌注損傷，而在其后心肌修復(fù)中心肌重構(gòu)對心功能有重要的影響。一方面梗死區(qū)發(fā)生修復(fù)性纖維化，維持心臟結(jié)構(gòu)，防止室壁破裂，另一方面非梗死區(qū)纖維化則使心臟順應(yīng)性降低，影響了心肌收縮和舒張功能。而如何調(diào)節(jié)心肌纖維化進(jìn)程，使梗死后心肌更好恢復(fù)功

11、能的則成為研究重點(diǎn)。
　　 心肌組織經(jīng)過缺血再灌注，部分心肌細(xì)胞壞死形成梗死區(qū)，經(jīng)過炎癥過程從而發(fā)生纖維化以修復(fù)替代壞死的心肌組織形成疤痕組織。成肌纖維細(xì)胞是一種由心肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來，具有收縮活性的細(xì)胞，對心肌損傷的修復(fù)起重要作用。TGF-β1信號通路被證明可誘導(dǎo)成肌纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化形成，而體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明在高氧條件下可激活TGF-β1信號通路可增加心肌成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
　　 我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過急性缺

12、血再灌注60分鐘后，小鼠心肌組織氧分壓明顯高于缺血前出現(xiàn)組織高氧狀態(tài)。而在eNOS基因敲除小鼠或是eNOS 活性抑制劑干預(yù)小鼠經(jīng)過缺血再灌注后組織的氧分壓明顯低于野生型小鼠，提示eNOS 產(chǎn)生的NO是參與調(diào)節(jié)缺血再灌注產(chǎn)生高氧狀態(tài)的重要因素。本次實(shí)驗(yàn)中，我們將長期監(jiān)測缺血再灌注后組織氧分壓變化情況，闡明心肌缺血區(qū)內(nèi)成肌纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化機(jī)制與再灌后的組織高氧之間關(guān)系，以期揭示心肌重構(gòu)調(diào)控機(jī)制，對心肌纖維化區(qū)域靶向調(diào)節(jié)提供依據(jù)。
　　

13、 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 分別建立心肌缺血再灌注和心肌組織高氧兩種小鼠模型。
　　 一、建立小鼠心肌缺血再灌注模型。結(jié)扎冠狀動脈左前降支30分鐘，而后開放灌注3天或14天；假手術(shù)組以相同方式開胸，但不做結(jié)扎。分為六個(gè)組，每組7只：（1）C57 野生型小鼠假手術(shù)組（C57 sham）；（2）C57 野生型小鼠缺血再灌注組（C57 I/R）；（3）eNOS基因敲除小鼠假手術(shù)組（eNOS-/-sham）；（4）eNOS基因敲除小鼠缺

14、血再灌注組（eNOS-/-I/R）；
　　 （5）iNOS基因敲除小鼠假手術(shù)組（iNOS-/-sham）；（6）iNOS基因敲除小鼠缺血再灌注組（iNOS-/-I/R）。血流再灌注60分鐘，1天，3天，5天，7天，14天利用電子順磁共振（EPR）波譜儀連續(xù)監(jiān)測心肌組織氧分壓，缺血再灌注前后利用激光多普勒血流監(jiān)測儀監(jiān)測血流再灌注情況。灌注14天后取心肌組織切片免疫組織化學(xué)染色。灌注3天時(shí)取心肌缺血區(qū)組織用ELISA和免疫印跡法檢測

15、TGF-β1，Smad，p21和α-SMA信號。
　　 二、建立組織高氧模型。C57 野生型小鼠置于95％氧氣+5％二氧化碳（95％O2+5％CO2）環(huán)境中處理3天，對照組處于正常空氣環(huán)境中。分為四組：（1）對照組（C57 sham）：正常空氣環(huán)境；（2）高氧處理組（Hyperoxygen treat）：95％ O2+5％CO2環(huán)境；（3）NO 供體SNAP 干預(yù)組（SNAP treat）：95％ O2+5％CO2環(huán)境并給以SN

16、AP 干預(yù)；（4）SOD 模擬物EUK134 干預(yù)組（EUK134 treat）：95％ O2+5％CO2環(huán)境并給以EUK134 干預(yù)。
　　 結(jié)論：
　　 小鼠缺血再灌注引起的心肌組織高氧狀態(tài)可誘導(dǎo)TGF-β1-Smad信號通路增加，并上調(diào)p21而增加α-SMA表達(dá)，促進(jìn)梗死區(qū)成肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化形成；而NO對高氧誘導(dǎo)的TGF-β1激活通路產(chǎn)生反饋性抑制調(diào)節(jié)作用。這一機(jī)制的闡明對心肌梗死修復(fù)的干預(yù)治療提供了新的觀點(diǎn)和視野。