CARD9在心肌缺血再灌注損傷中的作用及機制研究.pdf

1、冠心病是威脅人類健康的重大疾病，據(jù)《中國衛(wèi)生和計劃生育年鑒2013版》統(tǒng)計，我國2012年心血管疾病造成的死亡率為13.164/萬，占全部疾病導致死亡總數(shù)的21.45％。其中因缺血性心血管疾病導致的死亡占心血管疾病總死亡率的93.17%。目前臨床治療缺血性心臟病的常規(guī)血管再灌注治療方式包括藥物溶栓治療、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療術(shù)、冠狀動脈旁路移植術(shù)等，挽救了大量缺血性心臟病患者的生命。但是，伴隨治療過程發(fā)生的缺血再灌注損傷（ischemia

2、-reperfusion injury，IRI）越來越引起重視，無論圍術(shù)期還是遠期預后都可能對患者造成進一步的危害，導致遠期心血管不良事件的再次發(fā)生。因此，臨床迫切需要探索新的干預靶點和策略防治缺血再灌注損傷。
　　心肌缺血再灌注損傷（Myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）的發(fā)生機制涉及多種病理生理行為，其中炎癥反應是MIRI中重要環(huán)節(jié)。缺血再灌注損傷會激活固有免疫應答，從而造成過

3、度的炎癥反應。過度的炎癥反應導致活性氧簇（Reactive Oxygen Species，ROS）的分泌、免疫細胞的浸潤、血管內(nèi)皮的損傷，進而損傷心肌組織。而心肌梗死后期，炎癥反應參與了組織修復。多項以炎癥反應為治療靶點的臨床實驗以失敗告終，其可能的原因是非選擇性的阻斷或抑制炎癥反應。
　　胱天蛋白酶募集域蛋白9（Caspase Recruitment Domain containing protein9，CARD9）是迄今為止發(fā)

4、現(xiàn)的最重要的免疫銜接蛋白之一，存在于中性粒細胞、巨噬細胞等骨髓來源的免疫細胞中。既往報道，CARD9缺陷的小鼠或者人類，表現(xiàn)出對真菌等病原體的抵抗能力下降。研究表明，敲除CARD9會導致巨噬細胞分泌細胞因子能力的下降。在血管緊張素II誘導的高血壓心臟病模型中，敲除 CARD9可減少血管緊張素II對心功能的影響。我們前期研究證明，在高脂喂養(yǎng)的肥胖模型中，敲除CARD9可通過減弱炎癥反應進而降低肥胖對心臟功能的影響。而CARD9在心肌缺血再

5、灌注損傷中的作用尚不清楚。是否可以通過調(diào)控CARD9，進而影響MIRI中的炎癥反應，最終達到降低心肌缺血再灌注損傷的效果尚不清楚。因此，我們在本課題中以此為科學假說開展研究，以期證明CARD9在心肌缺血再灌注損傷的作用及其可能的機制，并為MIRI的有效干預提供新的分子靶點。
　　研究目的：
　　1.明確CARD9基因敲除是否會降低缺血再灌注損傷
　　2.闡明CARD9基因通過何種方式影響缺血再灌注后心肌損傷
　　

6、3.明確CARD9參與缺血再灌注調(diào)控的上下游具體分子機制
　　研究方法：
　　1.CARD9敲除對缺血再灌注后心肌損傷的作用研究
　　通過基因篩選鑒定 CARD9-/-小鼠，制備小鼠心肌缺血及心肌缺血再灌注模型，Western blot檢測CARD9在心臟中的表達，小動物超聲檢測及血流動力學檢測小鼠心臟功能，Evens blue/ TTC雙染法檢測小鼠心肌缺血再灌注后心肌梗死面積，TUNEL染色測定小鼠心肌細胞凋亡率。

7、
　　2.CARD9基因參與氧化應激調(diào)節(jié)缺血再灌注后心肌損傷的在體研究
　　制備小鼠心肌缺血及心肌缺血再灌注模型，通過Gr-1免疫熒光染色檢測中性粒細胞的浸潤，通過DCF熒光探針檢測ROS的浸潤，通過ELISA試劑盒檢測心肌組織和血清中的TNF-α、IL-6、MCP-1以及CXCL-1的含量，通過 Western blot檢測心肌組織p38及p65的表達。
　　3.CARD9通過NOD2-MAPK調(diào)控中性粒細胞炎癥反應

8、參與心肌缺血再灌注損傷的分子機制研究
　　a)分離小鼠腹腔來源的中性粒細胞
　　b)將分離純化的中性粒細胞與H9c2心肌細胞共培養(yǎng)，加入MDP以激活CARD9
　　c)通過TUNEL染色檢測共培養(yǎng)心肌的凋亡情況
　　d)通過 ELISA試劑盒檢測中性粒細胞上清中的TNF-α、IL-6、MCP-1以及CXCL-1的含量
　　e)通過Western blot檢測中性粒細胞中CARD9、p38及p65的表達

9、>　　研究結(jié)果：
　　1．敲除CARD9可減少小鼠心肌缺血再灌注后的心肌損傷
　　a)缺血再灌注損傷后CARD9的表達上調(diào)
　　b)敲除CARD9改善了小鼠心肌缺血再灌注損傷后的LVEF，LVEDP，+dp/dtmax和-dp/dtmax
　　c)敲除CARD9減少了缺血再灌注損傷后的心肌梗死面積及細胞凋亡
　　2．敲除CARD9減少了心肌缺血再灌所導致的炎癥反應
　　a)在缺血再灌注損傷后，與野生型

10、小鼠相比，敲除CARD9減少了心肌缺血再灌所導致的中性粒細胞浸潤
　　b)在缺血再灌注損傷后，與野生型小鼠相比，敲除CARD9減少了心肌缺血再灌所導致的氧化應激，心肌組織中ROS的含量
　　c)敲除CARD9減少了心肌組織及血清中由于缺血再灌所導致的TNF-α、IL-6、MCP-1以及CXCL-1細胞因子的分泌
　　d)與野生型小鼠相比，CARD9敲除小鼠缺血再灌注損傷后心肌組織中p38、p65磷酸化水平降低
　

11、　3．CARD9通過NOD2-MAPK影響中性粒細胞的炎癥反應
　　a)與野生型中性粒細胞相比，敲除CARD9減少中性粒細胞造成的心肌細胞凋亡
　　b)與野生型中性粒細胞相比，敲除CARD9減少降低細胞上清中，中性粒細胞分泌的TNF-α、IL-6、MCP-1以及CXCL-1的含量
　　c)加入MDP可上調(diào)CARD9；與野生型中性粒細胞相比，敲除CARD9降低中性粒細胞的p38磷酸化，而不影響p65的磷酸化水平