SOCS2在糖尿病心肌缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)旨在獲得糖尿病心肌缺血再灌注損傷小鼠心肌的差異基因表達(dá)譜，并在細(xì)胞水平應(yīng)用大鼠心肌細(xì)胞系H9c2高糖培養(yǎng)和缺氧復(fù)氧處理模擬糖尿病心肌缺血再灌注損傷，檢測SOCS2的mRNA水平，之后利用特異性siRNA下調(diào)SOCS2，研究SOCS2介導(dǎo)的高糖及缺氧復(fù)氧所致H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡的作用及分子機(jī)制。
　　方法：⑴通過高脂飲食和結(jié)扎心臟左冠脈前降支建立糖尿病小鼠和心肌缺血再灌注小鼠模型。⑵提取正常小鼠、糖尿病小鼠及糖

2、尿病心肌缺血再灌注小鼠的心肌組織RNA并通過基因芯片獲得mRNA表達(dá)譜，分析得到差異性表達(dá)基因，結(jié)合文獻(xiàn)檢索，挑選從未報(bào)道與糖尿病心肌缺血再灌注損傷相關(guān)的關(guān)鍵基因進(jìn)一步研究，并利用實(shí)時定量PCR技術(shù)檢測所挑選基因在動物模型中的表達(dá)情況是否與基因芯片結(jié)果一致。⑶在大鼠心肌細(xì)胞系H9c2中利用高糖培養(yǎng)和缺氧復(fù)氧處理來模擬糖尿病和心肌缺血再灌注模型，并通過特異性siRNA下調(diào)目的基因的表達(dá)，通過檢測Cleaved-casp3、GRP78的蛋白

3、表達(dá)水平及乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）的含量觀察H9c2在高糖和缺氧復(fù)氧條件下的凋亡情況和氧化應(yīng)激情況，并利用實(shí)時定量PCR和Western Blot技術(shù)檢測各組細(xì)胞中細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子-2（SOCS2）和胰島素樣生長因子-1（IGF-1）的mRNA和蛋白表達(dá)水平，以及JAK-STAT通路相關(guān)指標(biāo)（JAK2，p-JAK2，STAT5b，p-STAT5b）的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：①成功得到糖尿病小鼠和糖尿病心肌缺

4、血再灌注小鼠模型。②基因芯片檢測結(jié)果顯示，307個基因在糖尿病小鼠組中的表達(dá)發(fā)生了改變（與正常小鼠相比），1687個基因在糖尿病心肌缺血再灌注小鼠組中的表達(dá)發(fā)生了改變（與糖尿病小鼠相比），進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)GADD45b，Angptl4，SOCS2和RNF122在兩個表達(dá)譜中均呈上調(diào)趨勢，提示這些基因可能參與了糖尿病心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生。對上述基因分別進(jìn)行文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)SOCS2和RNF122與糖尿病心肌缺血再灌注損傷未見相關(guān)報(bào)道。③

5、利用缺氧盒建立細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型，發(fā)現(xiàn)隨著缺氧時間的延長，細(xì)胞的凋亡率逐漸升高（對照組細(xì)胞凋亡率為3.8％，缺氧2h、4h、6h、8h后分別為7%、11.54%、18.59%、23.54%），選取6h作為后續(xù)的缺氧時間，進(jìn)行復(fù)氧實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示隨著復(fù)氧時間的延長，細(xì)胞的凋亡率逐漸升高（缺氧6h細(xì)胞凋亡率為19.49%，復(fù)氧2h、4h、6h后分別為22.4%、27.96%、34.8%），選取缺氧6h/復(fù)氧4h為最終的造模時間。④高糖和缺氧復(fù)氧

6、致心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的變化情況：與對照組相比，高糖和缺氧復(fù)氧處理組細(xì)胞中Cleaved-casp3、GRP78的蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)（p<0.01），同時LDH、MDA的含量明顯升高（p<0.01）；高糖合并缺氧復(fù)氧組與高糖組或缺氧復(fù)氧組相比， Cleaved-casp3、GRP78的蛋白表達(dá)水平及LDH、MDA的含量進(jìn)一步上調(diào)（p<0.01）。⑤高糖和缺氧復(fù)氧致心肌細(xì)胞SOCS2和IGF-1的變化情況：與對照組相比，高糖組和缺氧復(fù)

7、氧組SOCS2的mRNA水平明顯上調(diào)（p<0.01），IGF-1的mRNA水平明顯下調(diào)（p<0.01）；高糖合并缺氧復(fù)氧組與高糖組或缺氧復(fù)氧組相比，SOCS2的mRNA水平進(jìn)一步上調(diào)（p<0.01），同時IGF-1的mRNA水平進(jìn)一步下調(diào)（p<0.01）。（6）利用SOCS2的特異性siRNA下調(diào)基因的表達(dá)后，細(xì)胞SOCS2的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低（p<0.01），p-JAK2及p-STAT5b蛋白水平明顯上調(diào)（p<0.01），