缺血后處理減輕大鼠心肌缺血-再灌注損傷及其增強干細胞治療心肌梗死效果.pdf

1、目的：本研究旨在探討：(1)缺血后處理是否通過阻斷線粒體滲透性轉(zhuǎn)換減輕心肌細胞凋亡及超微結(jié)構(gòu)損傷；(2)在心肌梗死后、再灌注前，對遠隔的另一心肌區(qū)域進行短暫、反復(fù)非梗死性缺血，能否減輕缺血／再灌注損傷，及其可能機制；(3)缺血后處理減輕缺血／再灌注損傷、調(diào)控心肌微環(huán)境，能否進而增強移植干細胞的存活及修復(fù)梗死心肌的能力，及其可能機制。 方法：(1) SD大鼠給予麻醉、開胸，結(jié)扎左主冠狀動脈(LCA)30min，之后持續(xù)再灌注5mi

2、n或120min，隨機分為8組(n=12)：假手術(shù)組，未予缺血；對照組，未予其它處理；缺血后處理組，于再灌注前給予3個循環(huán)的10秒再灌注及10秒缺血；缺血預(yù)處理組，于30min缺血前給予3個循環(huán)的5min缺血及5min再灌注；其余4組給予線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔阻斷劑環(huán)孢霉素A或開放劑蒼術(shù)苷。TTC法檢測心肌梗死面積。電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)。分光光度法檢測線粒體滲透性轉(zhuǎn)換。TUNEL法檢測細胞凋亡。(2)SD大鼠給予結(jié)扎LCA30min，之后持續(xù)再

3、灌注120min，隨機分為6組(n=8)：對照組；心臟內(nèi)遠隔缺血后處理組，于開放LCA前，對冠狀動脈旋支進行3個循環(huán)的結(jié)扎10秒及開放10秒；蒼術(shù)苷組，靜脈給予蒼術(shù)苷；心臟內(nèi)遠隔缺血后處理+蒼術(shù)苷組：經(jīng)典缺血后處理組；假手術(shù)組。檢測心肌梗死面積、心肌細胞超微結(jié)構(gòu)。血流動力學(xué)法檢測心臟功能，分光光度法檢測炎癥反應(yīng)。(3)貼壁培養(yǎng)法獲取SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)，使用攜帶綠色熒光蛋白(GFP)基因的慢病毒進行標(biāo)記。SD大鼠給予結(jié)

4、扎LCA30min，之后持續(xù)再灌注72小時或28天，隨機分為5組(n=16)：對照組；缺血后處理組；單純干細胞移植組，于再灌注120min，經(jīng)心肌局部注射GFP標(biāo)記的BMSCs；缺血后處理+干細胞移植組；假手術(shù)組。移植70小時(再灌注72小時)，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)及免疫組化法檢測炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β及抗炎因子IL-10表達；Western-blot及Real-time PCR法檢測抗凋亡因子

5、BCL-2及促凋亡因子BAX表達。移植70小時及28天，免疫熒光染色法檢測存活的GFP陽性的BMSCs及其分化。移植28天，Real-time PCR及Westem-blot或免疫組化法檢測旁分泌因子血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)及金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)表達；免疫組化法檢測血管再生；Masson染色法檢測膠原沉積；超聲心動圖法檢測心臟功能。 結(jié)

6、果：(1)與對照組比較，缺血后處理、環(huán)孢霉素A及缺血預(yù)處理組心肌梗死面積明顯縮小，代表線粒體滲透性轉(zhuǎn)換程度的540nm光密度值下降百分比明顯降低(20.2％±2.3％vs.12.1％±1.8％，11.2％±3.3％，12.1％±5.6％，P＜0.01)，線粒體評分更低(2.09±0.27 vs.1.27±0.27.0.97±0.26，1.28±0.32，P＜0.01)，細胞凋亡指數(shù)更小(34.9％±2.6％vs.17.5％±1.7％，1

7、7.6％±2.1％，17.2％±2.1％，P＜0.01)。蒼術(shù)苷能阻斷、而環(huán)孢霉素 A未能增強缺血后處理的心臟保護作用。(2)與對照組比較，持續(xù)再灌注結(jié)束時，心臟內(nèi)遠隔缺血后處理組及經(jīng)典缺血后處理組心肌梗死面積縮小(49.1％±5.2％vs.32.0％±5.5％，26.4％±5.0％，P＜0.05)，左室±dP/dtmax增高(+dP/dtmax，5983±620mmHg/svs.6938±690mmHg/s，6897±810mmHg/

8、s，P＜0.05；-dP/dtmax，5408±655mmHg/s vs.6235±649mmHg/s，6139±620mmHg/s，P＜0.05)，超微結(jié)構(gòu)損傷減輕，血漿及缺血心肌組織丙二醛活性降低、超氧化物岐化酶活性增高，缺血心肌組織髓過氧化物酶活性降低。蒼術(shù)苷阻斷心臟內(nèi)遠隔缺血后處理的心臟保護作用。(3)與對照組比較，再灌注早期(72小時)，缺血后處理組、單純干細胞移植組及缺血后處理+干細胞移植組降低炎癥及促凋亡因子水平，增強抗炎

9、及抗凋亡因子表達，缺血后處理+干細胞移植組的有益作用強于單純干細胞移植組(P＜0.05)。缺血后處理+干細胞移植組無論是移植70小時還是28天，GFP陽性細胞數(shù)均顯著高于單純干細胞移植組(移植70小時，90士14/mm2 vs。61±12/mm2，P＜0.01；移植28天，55±14/mm2 vs.26±8/mm2，P＜0.01)；沒有發(fā)現(xiàn)GFP陽性細胞向心肌細胞分化。移植28天，缺血后處理組、單純干細胞移植組及缺血后處理+干細胞移植組

10、心功能高于對照組(左室射血分數(shù)，LVEF，69％±6％，75％±4％，82％±4％vs.62％±8％，P＜0.05)，缺血后處理+干細胞移植組與單純干細胞移植組之間LVEF存在差異(P＜0.05)。單純干細胞移植組及缺血后處理+干細胞移植組生長因子表達、梗死區(qū)域毛細血管密度均高于對照組(P<0.01)，兩組之間也均存在差異(P<0.01)。相對于對照組，缺血后處理組、單純干細胞移植組及缺血后處理+干細胞移植組阻斷膠原沉積及MMP-9表達

11、，增強TIMP-1表達：缺血后處理+干細胞移植組的上述作用較缺血后處理組及單純干細胞移植組更強(P<0.05)。 結(jié)論：(1)阻斷線粒體滲透性轉(zhuǎn)換可能參與缺血后處理減輕心肌細胞凋亡及超微結(jié)構(gòu)損傷。(2)心臟內(nèi)遠隔缺血后處理縮小心肌梗死面積，減輕缺血／再灌注損傷，阻斷線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔的開放可能參與這種心臟保護作用。(3)缺血后處理通過減輕缺血／再灌注損傷、調(diào)控心肌微環(huán)境，可以進而增強移植干細胞的存活及修復(fù)梗死心肌的能力，旁分泌機