維生素C缺血后處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用的研究.pdf

1、在本研究中，我們探討維生素C缺血后處理是否對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，并且進(jìn)一步研究其保護(hù)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要包括以下兩部分:
　　第一部分 維生素C缺血后處理對(duì)離體大鼠心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制研究
　　目的:探討維生素C缺血后處理對(duì)離體大鼠全心臟缺血再灌注損傷是否具有保護(hù)作用，以及其對(duì)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)和線粒體ATP敏感性鉀通道的影響作用。
　　方法:利用主動(dòng)脈逆行灌注(Langend

2、orff)心臟離體模型，全心缺血30min，再灌注120min，檢測心肌梗死面積、血流動(dòng)力學(xué)、灌流液中乳糖脫氫酶(LDH)的含量、心肌組織ATP和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）含量并觀察心肌超微結(jié)構(gòu)。利用mPTP開放劑LND和mitoKATP通道阻斷劑5-HD探討mPTP和mitoKATP通道在VC保護(hù)心肌缺血再灌注損傷中的作用。
　　SD大鼠離體心臟隨機(jī)分成以下7組:
　　1.control組:心臟持續(xù)K-H緩沖液灌注;

3、
　　2.I/R組:全心缺血30 min和120 min再灌注;
　　3.VC組:，全心缺血30 min后給予VC2μM灌流30 min，120 min再灌注;
　　4.VC+5-HD組:首先給予5-HD（100μM）灌流20 min，然后全心缺血30 min后給予VC（2μM）30min，最后再灌注120 min;
　　5.VC+LND組:首先全心缺血30 min，然后給予VC（2μM）灌流30min，在再灌注

4、開始時(shí)刻，給予LND(30μM)灌流20 min，接著繼續(xù)再灌注100 min;
　　6.5-HD組:給予5-HD(100μM)灌流20 min，然后K-H緩沖液灌流30 min，行全心缺血30 min，再灌注120 min;
　　7.LND組:全心缺血30 min，在再灌注開始時(shí)刻，給予LND(30μM)灌流20 min，接著繼續(xù)再灌注100 min。
　　結(jié)果:
　　1.VC對(duì)缺血再灌注后心肌梗死面積的影響。

5、
　　2.VC對(duì)血流動(dòng)力學(xué)的影響。
　　3.VC對(duì)LDH的影響。
　　4.VC對(duì)心肌內(nèi)ATP水平的影響。
　　5.VC對(duì)mPTP的影響。
　　6.心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　結(jié)論:
　　1.在離體Langendorff心臟缺血再灌注模型中，維生素C缺血后處理減少缺血再灌注后心肌梗死面積，并且在2μM濃度缺血后處理30min條件下，維生素C發(fā)揮最大的心肌保護(hù)作用。
　　2.維生素C缺血后處

6、理改善缺血再灌注后心肌的血流動(dòng)力學(xué)，減少缺血再灌注后LDH水平。
　　3.維生素C缺血后處理增加了缺血再灌注后心肌組織ATP的含量，改善心肌能量代謝。
　　4.維生素C缺血后處理增加了缺血再灌注后心肌組織NAD+的含量，抑制mPTP的開放。
　　5.維生素C缺血后處理明顯減輕線粒體的超微結(jié)構(gòu)的病理改變，降低了心肌細(xì)胞的損傷程度。
　　6.維生素C的上述作用可被mitoKATP通道的阻斷劑5-HD或mPTP的開放劑

7、LND取消。說明維生素C的心肌保護(hù)作用是通過活化mitoKATP通道和抑制mPTP開放介導(dǎo)的，并且mitoKATP通道可能位于mPTP的上游。
　　第二部分 維生素C缺血后處理對(duì)大鼠原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞氧糖剝奪再灌注損傷的保護(hù)作用
　　目的:研究維生素C缺血后處理對(duì)原代乳鼠心肌細(xì)胞氧糖剝奪再灌注損傷是否具有保護(hù)作用。
　　方法:從出生1-3 d SD大鼠分離培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞。建立體外氧糖剝奪再灌注細(xì)胞模型，心肌細(xì)胞經(jīng)歷氧糖

8、剝奪10h，再灌注3h。實(shí)驗(yàn)分組:
　　1.control組:應(yīng)用含10％ FBS的DMEM培養(yǎng)基，于5％CO237℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　2.OGD/R組:氧糖剝奪10h，再灌注3h。
　　3.VC組:在進(jìn)行OGD后，加入終濃度為2μM的VC與細(xì)胞孵育3h，棄原培養(yǎng)液，用無糖DMEM清洗細(xì)胞2次，然后進(jìn)行再灌注。
　　4.VC+5-HD組:首先給予細(xì)胞5-HD100μM孵育20 min，然后棄培養(yǎng)液，用無糖DME

9、M清洗細(xì)胞2次，然后進(jìn)行氧糖剝奪，最后換為終濃度為2μM的VC與細(xì)胞孵育3h，恢復(fù)再灌注。
　　5.VC+LND組:首先進(jìn)行氧糖剝奪10h，加入終濃度為2μM的VC與細(xì)胞孵育3h，用無糖DMEM清洗細(xì)胞2次。在恢復(fù)氧氣和糖供應(yīng)時(shí)，更換為含有30μMLND的正常培養(yǎng)基，孵育20 min后，用正常DMEM培養(yǎng)基清晰細(xì)胞2次，然后換為含10％ FBS的DMEM培養(yǎng)基，在5％CO237℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)160 min，共計(jì)3h。
　

10、　6.5-HD組:在進(jìn)行氧糖剝奪前，給予細(xì)胞100μM的5-HD孵育20min，棄去培養(yǎng)基，用正常的DMEM培養(yǎng)基清洗細(xì)胞2次，然后繼續(xù)正常培養(yǎng)，共計(jì)3h，之后進(jìn)行OGD/R。
　　7.LND組:細(xì)胞進(jìn)行氧糖剝奪，在恢復(fù)氧氣和葡萄糖供應(yīng)的時(shí)候，更換為含有30μM LND的正常培養(yǎng)基，孵育20 min后，用正常DMEM培養(yǎng)基清晰細(xì)胞2次，然后換為含10％ FBS的DMEM培養(yǎng)基，在5％CO237℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)160 min，共計(jì)

11、3h。
　　心肌細(xì)胞再灌注結(jié)束后，利用MTT法測定心肌細(xì)胞活力，測定培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)含量從而判斷細(xì)胞受損程度。利用流式細(xì)胞技術(shù)及激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)測定細(xì)胞中的活性氧ROS，利用激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)測定mPTP開放情況、胞漿內(nèi)鈣濃度、線粒體內(nèi)鈣濃度、線粒體膜電位。
　　結(jié)果:
　　1.VC缺血后處理對(duì)心肌細(xì)胞活力的影響。
　　2.VC對(duì)氧糖剝奪再灌注(OGD/R)心肌細(xì)胞LDH的影響。

12、　　結(jié)論:
　　1.VC缺血后處理增強(qiáng)OGD/R后心肌細(xì)胞活力。
　　2.VC降低氧糖剝奪再灌注(OGD/R)心肌細(xì)胞LDH的釋放。
　　第三部分維生素C缺血后處理對(duì)大鼠原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞氧糖剝奪再灌注損傷的保護(hù)作用的機(jī)制探討
　　目的:研究線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transitionpore，mPTP）和線粒體ATP敏感性鉀通道(mitochondrial ATP

13、-sensitivepotassium channels，mitoKATP, channels)在維生素C缺血后處理對(duì)原代乳鼠心肌細(xì)胞氧糖剝奪再灌注損傷中心臟保護(hù)的作用。
　　方法:從出生1-3 d SD大鼠分離培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞。建立體外氧糖剝奪再灌注細(xì)胞模型，心肌細(xì)胞經(jīng)歷氧糖剝奪10h，再灌注3h。
　　實(shí)驗(yàn)分組:
　　1.control組:應(yīng)用含10％ FBS的DMEM培養(yǎng)基，于5％CO237℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

14、>　　2.OGD/R組:氧糖剝奪10h，再灌注3h。
　　3.VC組:在進(jìn)行OGD后，加入終濃度為2μM的VC與細(xì)胞孵育3h，棄原培養(yǎng)液，用無糖DMEM清洗細(xì)胞2次，然后進(jìn)行再灌注。
　　4.VC+5-HD組:首先給予細(xì)胞5-HD100μM孵育20 min，然后棄培養(yǎng)液，用無糖DMEM清洗細(xì)胞2次，然后進(jìn)行氧糖剝奪，最后換為終濃度為2μM的VC與細(xì)胞孵育3h，恢復(fù)再灌注。
　　5.VC+LND組:首先進(jìn)行氧糖剝奪10h

15、，加入終濃度為2μM的VC與細(xì)胞孵育3h，用無糖DMEM清洗細(xì)胞2次。在恢復(fù)氧氣和糖供應(yīng)時(shí)，更換為含有30μM LND的正常培養(yǎng)基，孵育20 min后，用正常DMEM培養(yǎng)基清晰細(xì)胞2次，然后換為含10％ FBS的DMEM培養(yǎng)基，在5％CO237℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)160 min，共計(jì)3h。
　　6.5-HD組:在進(jìn)行氧糖剝奪前，給予細(xì)胞100μM的5-HD孵育20min，棄去培養(yǎng)基，用正常的DMEM培養(yǎng)基清洗細(xì)胞2次，然后繼續(xù)正常培

16、養(yǎng)，共計(jì)3h，之后進(jìn)行OGD/R。
　　7.LND組:細(xì)胞進(jìn)行氧糖剝奪，在恢復(fù)氧氣和葡萄糖供應(yīng)的時(shí)候，更換為含有30μM LND的正常培養(yǎng)基，孵育20 min后，用正常DMEM培養(yǎng)基清晰細(xì)胞2次，然后換為含10％ FBS的DMEM培養(yǎng)基，在5％CO237℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)160 min，共計(jì)3h。
　　心肌細(xì)胞再灌注結(jié)束后，利用流式細(xì)胞技術(shù)及激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)測定細(xì)胞中的活性氧ROS，利用激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)測定m

17、PTP開放情況、胞漿內(nèi)鈣濃度、線粒體內(nèi)鈣濃度、線粒體膜電位。
　　結(jié)果:
　　1.VC缺血后處理對(duì)mPTP開放程度的影響。
　　2.VC缺血后處理對(duì)ROS的影響。
　　3.VC缺血后處理對(duì)鈣濃度的影響。
　　4.VC缺血后處理對(duì)線粒體膜電位的影響。
　　結(jié)論:
　　1.維生素C缺血后處理降低OGD/R后mPTP的開放程度。
　　2.維生素C缺血后處理減少OGD/R后ROS產(chǎn)物，減輕氧化應(yīng)激

18、。
　　3.維生素C缺血后處理降低OGD/R后細(xì)胞內(nèi)及線粒體內(nèi)鈣濃度，減輕鈣超載。
　　4.維生素C缺血后處理減少OGD/R后線粒體膜電位的下降，維持線粒體膜電位。
　　5.維生素C的上述作用可被mitoKATP通道的阻斷劑5-HD或mPTP的開放劑氯尼達(dá)明（lonidamine，LND）抑制。維生素C的心肌保護(hù)機(jī)制可能是通過減少ROS活化mitoKATP通道，減少鈣超載，進(jìn)而抑制mPTP的開放及線粒體膜電位的去極化。