明膠蛋白酶及其抑制劑在大鼠局部腦缺血再灌注損傷中的作用研究.pdf

1、第一部分
　　 目的：應(yīng)用不同的磁共振成像序列，活體觀察實(shí)驗(yàn)大鼠腦缺血再灌注損傷不同時(shí)期的病理生理過(guò)程，為腦保護(hù)治療提供精確的神經(jīng)影像學(xué)信息。
　　 方法：14只健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為手術(shù)組和假手術(shù)組，每組各分為再灌注24h和再灌注5d兩個(gè)亞組。線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞1.5h再灌注模型。所有大鼠分別于線栓插入及拔出后立即行PWI；再灌注0h、3.5h及24h行DWI；再灌注3.5h、24h及5d行常規(guī)T2

2、WI和Gd-DTPA增強(qiáng)T1WI；再灌注24h及5d行T2*WI。測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)MRI異常信號(hào)體積和增強(qiáng)掃描信號(hào)強(qiáng)化區(qū)域體積及平均信號(hào)強(qiáng)度值。結(jié)果以體積比(異常信號(hào)體積/ 同側(cè)半球體積×100[％])，強(qiáng)度比(異常信號(hào)平均信號(hào)強(qiáng)度值/ 對(duì)側(cè)鏡像區(qū)平均信號(hào)強(qiáng)度值×100[％])表示。
　　 結(jié)果：成功大鼠模型PWI顯示造影劑首次通過(guò)時(shí)，雙側(cè)大腦半球信號(hào)衰減于線栓置入時(shí)呈不對(duì)稱性改變，線栓拔出后立即恢復(fù)。手術(shù)組大鼠：缺血1.5h后D

3、WI即顯示異常高信號(hào)，高信號(hào)體積隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)而增加(P<0.05)；腦缺血再灌注3.5h后T2WI和T1WI增強(qiáng)掃描均顯示異常高信號(hào)，高信號(hào)體積隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)而增加，再灌注5d后有所下降(P<0.05)，強(qiáng)化區(qū)域的平均信號(hào)強(qiáng)度值隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)遞增(P<0.05)；再灌注24h及5d T2*WI上均無(wú)異常信號(hào)出現(xiàn)。假手術(shù)組大鼠所有MRI序列上均無(wú)異常改變。
　　 結(jié)論：合理應(yīng)用不同的磁共振成像序列可以為超早期腦梗死的診斷，

4、BBB損傷的范圍及程度、血管源性水腫、腦梗死灶體積的評(píng)價(jià)提供實(shí)時(shí)、詳盡、個(gè)體化的影像學(xué)信息，有利于我們動(dòng)態(tài)觀察缺血腦組織的病理變化，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)藥物干預(yù)的治療效果。
　　 第二部分
　　 目的：探討腦缺血再灌注不同時(shí)期體內(nèi)明膠蛋白酶活性與BBB損傷之間的相關(guān)性，明確其在腦缺血再灌注微血管損傷中的作用及地位。
　　 方法：34只健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為手術(shù)組和假手術(shù)組，每組各分為再灌注24h和再灌注5d兩個(gè)亞組

5、。線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞1.5h再灌注模型。所有大鼠分別于再灌注3.5h、24h及5d行Gd-DTPA增強(qiáng)T1WI掃描。明膠酶譜分析法檢測(cè)缺血再灌注24h及5d后腦組織、血清MMP-2、MMP-9活性，并與MRI作相關(guān)回歸分析。免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)缺血腦組織MMP-9的表達(dá)與分布。
　　 結(jié)果：腦缺血再灌注24h，手術(shù)組大鼠腦組織MMP-2、MMP-9活性顯著升高(P<0.05)；再灌注5d，MMP-2活性繼續(xù)升高(P<0

6、.05)，MMP-9則下降至檢測(cè)水平以下。假手術(shù)組大鼠腦組織中僅檢測(cè)到少量MMP-2，未見MMP-9水解條帶，兩者活性隨時(shí)間變化不明顯(P>0.05)。腦缺血再灌注24h，手術(shù)組大鼠血清MMP-2、MMP-9活性顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；再灌注5d，兩者活性繼續(xù)升高(P<0.05)。假手術(shù)組大鼠血清MMP-2、MMP-9活性隨時(shí)間變化不明顯(P>0.05)。腦缺血再灌注24h，腦組織MMP-9活性與T1WI上信號(hào)強(qiáng)化范圍呈明顯正

7、相關(guān)，(r=0.96，p<0.001)；MMP-9免疫組化陽(yáng)性染色分布與T1WI上信號(hào)強(qiáng)化區(qū)一致。
　　 結(jié)論：腦組織明膠蛋白酶活性增高是導(dǎo)致缺血再灌注早期血腦屏障通透性升高、腦水腫加重的重要因素，其中MMP-9與腦缺血再灌注導(dǎo)致的神經(jīng)血管損傷關(guān)系尤為密切。
　　 第三部分
　　 目的：檢測(cè)腦缺血再灌注不同時(shí)期腦組織MMP-2、MMP-9及其組織抑制因子TIMP-1、TIMP-2轉(zhuǎn)錄及翻譯的變化，探討其表達(dá)特點(diǎn)。

8、
　　 方法：56只健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為手術(shù)組和假手術(shù)組，每組各分為再灌注24h和再灌注5d兩個(gè)亞組。線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞1.5h再灌注模型。應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)缺血再灌注24h及5d后腦組織MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)的變化；Western blot檢測(cè)缺血再灌注24h和5d腦組織MMP-2、 MMP-9及其組織抑制因子TIMP-2、TIMP-1蛋白含量的變化。
　　 結(jié)果：手術(shù)組大鼠腦缺血

9、再灌注24h MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)；再灌注5d后 MMP-9 mRNA表達(dá)迅速下降(P<0.05)，MMP-2 mRNA表達(dá)則繼續(xù)升高(P<0.05)。假手術(shù)組大鼠腦組織內(nèi)僅檢測(cè)到少量MMP-2 mRNA的表達(dá)，且隨時(shí)間變化不明顯(P>0.05)。手術(shù)組大鼠腦缺血再灌注24h TIMP-1、TIMP-2蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高(P<0.05)，再灌注5d TIMP-1表達(dá)迅速下降(P<0.05)

10、，TIMP-2表達(dá)仍繼續(xù)增加(P<0.05)。假手術(shù)組大鼠腦組織TIMP-1、TIMP-2呈低水平表達(dá)，隨時(shí)間變化不明顯。
　　 結(jié)論：缺血再灌注導(dǎo)致腦組織MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高，再灌注早期以MMP-9升高為主，晚期則以MMP-2升高為主。TIMP-1和TIMP-2的表達(dá)模式與MMP-2、MMP-9表達(dá)一致，這可能與機(jī)體維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的自我調(diào)節(jié)有關(guān)。
　　 第四部分
　　 目的：觀察抗

11、-MMPs治療對(duì)腦缺血再灌注損傷的影響，為缺血性腦卒中的神經(jīng)保護(hù)治療尋找新的切入點(diǎn)。
　　 方法：28只健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為BB-94治療組和缺血對(duì)照組，每組各分為再灌注24h和再灌注5d兩個(gè)亞組。線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞1.5h再灌注模型。BB-94組大鼠于不同時(shí)間點(diǎn)腹腔注射廣譜MMPs抑制劑BB-94(50mg/kg)；缺血對(duì)照組大鼠相同時(shí)間點(diǎn)腹腔注射等體積生理鹽水。兩組大鼠分別于再灌注0h、3.5h及24h

12、行DWI掃描；再灌注3.5h、24h及5d行T2WI和Gd-DTPA增強(qiáng)T1WI掃描。腦缺血再灌注24h和5d后對(duì)所有大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評(píng)分。
　　 結(jié)果：BB-94組大鼠腦缺血再灌注3.5h及24h DWI上異常高信號(hào)體積明顯小于缺血對(duì)照組(P<0.05)；再灌注3.5h、24h及5d BB-94組大鼠T2WI上異常高信號(hào)體積及T1WI信號(hào)強(qiáng)化的范圍和強(qiáng)度亦明顯小于缺血對(duì)照組(P<0.05)。BB-94顯著降低了缺血再灌注2

13、4h和5d大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分(P<0.05)。
　　 結(jié)論：抗-MMPs治療能明顯減輕缺血再灌注后血腦屏障損傷的范圍和程度，縮小腦梗死灶體積，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，對(duì)腦缺血再灌注損傷具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　 第五部分
　　 目的：觀察米諾環(huán)素對(duì)腦缺血再灌注后BBB通透性、梗死灶體積以及神經(jīng)功能恢復(fù)的影響進(jìn)行，探討其作用機(jī)制。
　　 方法：56只健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為米諾環(huán)素組和缺血對(duì)照組，每

14、組各分為再灌注24h和再灌注5d兩個(gè)亞組。線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞1.5h再灌注模型。兩組大鼠分別于再灌注0h、3.5h及24h行DWI掃描；再灌注3.5h、24h及5d行T2WI和Gd-DTPA增強(qiáng)T1WI掃描。腦缺血再灌注24h和5d后對(duì)所有大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評(píng)分和血清、腦組織明膠酶活性測(cè)定。應(yīng)用RT-PCR和Western blot分別考察米諾環(huán)素對(duì)缺血再灌注后腦組織MMP-2、MMP-9轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的影響，以及對(duì)TIMP

15、-1、TIMP-2蛋白表達(dá)的調(diào)控。
　　 結(jié)果：米諾環(huán)素組大鼠缺血再灌注3.5h及24h DWI上異常高信號(hào)體積明顯低于缺血對(duì)照組(P<0.05)；再灌注3.5h、24h及5d米諾環(huán)素組大鼠T2WI上異常高信號(hào)體積及T1WI信號(hào)強(qiáng)化的范圍和強(qiáng)度亦明顯小于缺血對(duì)照組(P<0.05)。米諾環(huán)素顯著降低了缺血再灌注24h和5d大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分(P<0.05)和腦組織明膠酶活性(P<0.05)，同時(shí)對(duì)缺血再灌注24h血清MMP-9及

16、再灌注5d 血清MMP-2的水解活性亦具有抑制作用(P<0.05)。腦缺血再灌注24h，米諾環(huán)素組大鼠腦組織MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)較缺血對(duì)照組顯著減少(P<0.05)，TIMP-2表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)，TIMP-1表達(dá)無(wú)組間差異(P>0.05)；腦缺血再灌注5d，米諾環(huán)素組大鼠腦組織MMP-2 mRNA及蛋白表達(dá)仍低于對(duì)照組(P<0.05)，TIMP-1、TIMP-2蛋白含量無(wú)明顯組間差異(P>0.05)，