糖原合酶激酶-3β抑制劑對大鼠肝臟熱缺血再灌注損傷的保護作用.pdf

1、目的我國是世界上肝臟和膽道疾病發(fā)病率最高的國家之一，外科手術(shù)是治療該系疾病的重要手段。肝葉切除術(shù)是肝臟及膽道外科中最常規(guī)、應用最為廣泛的術(shù)式。臨床上肝切除手術(shù)面臨的主要問題是如何有效地控制術(shù)中肝臟創(chuàng)面大出血。針對此，自1908年P(guān)ringle首先采用入肝血流阻斷法切除肝臟以來，迄今已有多種阻斷入肝血流方法應用于臨床，其中主要包括：第一肝門阻斷、單側(cè)入肝血流阻斷及全肝血流阻斷。這些方法的應用既可有效地控制手術(shù)出血量，使術(shù)野清晰，又能減少術(shù)

2、中醫(yī)源性損傷機會，并對維持患者血容量，減少手術(shù)并發(fā)癥的發(fā)生起到十分重要的作用。但入肝血流阻斷后無疑將會給肝臟帶來不可低估的熱缺血損傷。據(jù)此，目前臨床上對肝血流阻斷時限均持較謹慎的態(tài)度，一般以10-15min為宜，并以20min為度。所以，自入肝血流阻斷方法應用于臨床以來，如何既能最大限度地延長肝門血流阻斷時間以確保手術(shù)順利進行，又能有效地減輕肝臟熱缺血損傷程度以保證術(shù)后肝臟功能的恢復一直是人們探討的重點內(nèi)容。 隨著現(xiàn)代腹部外科的

3、不斷進步，肝臟移植技術(shù)作為治療終末期肝病的主要手段已無可非議，我國是世界上肝病發(fā)病率最高和因肝病引起肝功能衰竭導致死亡人數(shù)最多的國家之一，同時也是接受肝移植患者治療較多和肝移植發(fā)展較快的國家。肝臟缺血再灌注損傷是肝移植不可避免的一個過程，嚴重時可引起移植肝臟失功、其它器官損傷甚至病人死亡。因此，肝臟缺血再灌注損傷嚴重影響移植肝臟的存活質(zhì)量，尋找有效的干預措施是肝移植面臨的一項重要課題。 肝臟是一對缺血缺氧損傷尤為敏感的器官，肝臟

4、在缺血初期，肝細胞雖可通過無氧糖酵解來代償其能量不足，但隨著缺血時間的延續(xù)，胞漿內(nèi)貯存的能量代謝底物不斷耗竭，細胞無氧糖酵解功能也逐漸減退，最終將導致細胞內(nèi)ATP缺乏，繼而引發(fā)肝細胞結(jié)構(gòu)及功能損傷。既往我們研究發(fā)現(xiàn)，增加缺血前肝細胞糖原含量能有效拮抗家兔肝臟缺血再灌注損傷。但是我們也同時發(fā)現(xiàn)，肝細胞糖原含量上升到一定水平后，即使增加葡萄糖的用量，其含量并不增加。業(yè)已證實，糖原合成是單糖在酶的催化作用下的聚合反應，糖原合成酶是這一過程的關(guān)

5、鍵酶，其活性常受糖原合酶激酶.3 B( GlycogenSynthase Kinase-3β； GSK-3 B)的負調(diào)控，即GSK-3β通過催化糖原合成酶磷酸化使之失活而阻止糖原合成。因此，抑制GSK-3β可解除其對糖原合成酶的負調(diào)節(jié)作用，使糖原合成酶磷酸化減少，從而促進糖原的合成。由此，我們推測，抑制GSK-3β的活性有望提高肝臟合成糖原的能力，進而有效減輕肝臟缺血再灌注損傷。 基于以上認識，本研究在我們以前的工作基礎(chǔ)上，進一

6、步探討肝細胞內(nèi)預存糖原拮抗肝臟缺血再灌注損傷的機制，澄清GSK-3β在肝臟缺血再灌注損傷過程的作用及其機理，以及GSK-3β抑制劑對肝缺血再灌注損傷的干預效應。 方法:采用Lewis大鼠為實驗動物，進行下列三方面研究。 1.制備糖原含量顯著不同的三組大鼠肝臟模型，阻斷肝臟血流30min后恢復肝血流，分別于恢復血流后1、4、12及24h，測定血清ALT、AST含量、肝組織形態(tài)學觀察、原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶法(TUNEL法

7、)檢測肝細胞凋亡、實時定量PCR方法檢測肝細胞Bcl-2mRNA轉(zhuǎn)錄水平、觀察動物的1周生存率。 2.Lewis大鼠56只隨機分為正常組、假手術(shù)組和缺血再灌注組。后兩組分別于關(guān)腹或恢復血流后1、12及24 h，測定血清ALT、AST含量、肝組織形態(tài)學觀察、TUNEL法檢測肝細胞凋亡、采用免疫組織化學法檢測肝組織原位GSK-3β的表達、透射電鏡觀察肝組織結(jié)構(gòu)。正常組直接開腹取標本檢測上述指標。 3.Lewis大鼠64只隨機

8、分為4組，A組(假手術(shù)+空白對照)，B組(假手術(shù)+TDZD-8)、C組(缺血再灌注+空白對照)和D組(缺血再灌注+TDZD-8)。C組、D組阻斷肝門血流30 min后恢復肝臟血流。C組、D組分別于恢復血流后2、12 h，A組、B組于關(guān)腹后2、12h分別測定血清ALT、AST含量、肝組織形態(tài)學檢測、TUNEL法檢測肝細胞凋亡、采用實時定量PCR方法檢測肝細胞Bcl-2mRNA轉(zhuǎn)錄水平。 結(jié)果： 1.在肝臟缺血前預先給予大鼠

9、高濃度的葡萄糖可增加肝細胞的糖原含量。缺血前肝細 胞糖原含量越高，于缺血再灌注期各時相點肝組織結(jié)構(gòu)受損越輕；血清ALT、AST含量及肝細胞凋亡指數(shù)越低(P<0.05)；Bcl-2mRNA轉(zhuǎn)錄水平越高(P<0.05)；動物1周生存率越高(P<0.05)。 2.缺血再灌注組大鼠在恢復血流后的各時相點，GSK-3β的表達強于正常組和假手術(shù)組(P<0.05)，肝細胞凋亡指數(shù)、血清TNF-α含量也高于正常組和假手術(shù)組(P<0.05

10、)；肝組織原位GSK-3β表達越強，肝細胞凋亡指數(shù)越高；GSK-3β表達光密度值與肝細胞凋亡指數(shù)呈顯著性正相關(guān)；缺血再灌注組大鼠肝組織電鏡下可見明顯的凋亡小體。 3.D組在恢復血流后各時相點與C組同時相點、A組和B組關(guān)腹后同時相點比，肝組織結(jié)構(gòu)受損程度顯著減輕，血清ALT、AST含量及凋亡指數(shù)顯著降低(P<0.05)；而Bcl-2 mRNA轉(zhuǎn)錄則顯著上升(P<0.05)。 結(jié)論: 1.缺血前增加肝細胞糖原含量可顯