GSK-3β抑制劑對大鼠心臟缺血-再灌注損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、研究背景:
　　缺血性心臟病（IHD）是當今世界威脅人類健康的首敵。隨著冠狀動脈內(nèi)溶栓及冠脈搭橋等內(nèi)外科治療手段的廣泛應(yīng)用，繼之出現(xiàn)的心肌細胞再灌注損傷日益受到心臟病學(xué)家的高度重視。來自動物實驗和臨床觀察的證據(jù)表明，心臟缺血再灌注（MI/R）后局部組織過度的炎癥反應(yīng)是造成再灌注損傷的主要原因之一，也是心臟缺血繼發(fā)性損傷的重要病理生理機制。多項研究證實，p38絲裂原活化蛋白激酶（p38-MAPK)和核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）是各

2、器官I/R炎癥損傷中密切相關(guān)的兩個轉(zhuǎn)錄因子，并對炎癥介質(zhì)如TNF-α、IL-1β、IL-6和黏附分子（ICAM-1、VCAM-1）等的表達及凋亡細胞的調(diào)控發(fā)揮著重要作用。因此，藥物預(yù)處理下調(diào)p38MAPK和NF-κB的活性，有望成為控制TNF-α等表達的策略，從而減輕MI/R炎性損傷。
　　研究認為急性期MI/R損傷是固有免疫應(yīng)答的一部分，而導(dǎo)致這種非感染刺激炎癥應(yīng)答的機制部分是通過Toll樣受體（TLRs）介導(dǎo)的信號。TLRs在

3、心肌細胞的表達不但對心肌細胞誘導(dǎo)炎癥應(yīng)答帶來新的認識，同時也提供降低MI/R損傷的靶點。TLRs在缺血性心臟損傷中的作用研究才剛剛起步，目前和心臟缺血關(guān)系比較明確是TLR2和TLR4。TLR2和TLR4均可以識別缺血中損傷釋放的內(nèi)源性“危險信號”，這為TLRs和心臟缺血的關(guān)系研究提供了理論依據(jù)。MI/R增加TLR4mRNA和蛋白表達，TLR4激活下游MAPK、NF-κB等活性，隨后炎癥因子瀑布表達，引起心肌損傷。但在MI/R中TLR2表

4、達情況仍不清楚，藥物是否能降低心臟TLR2信號通路減輕炎性損傷的研究也未見報道。
　　目前，再灌注治療顯著促進急性心肌梗死(AMI)患者的預(yù)后，然而，將近25％患者再灌注治療不能提供足夠的存活心肌，而導(dǎo)致嚴重心力衰竭，故尋找安全有效的抗心肌缺血再灌注損傷藥物和方法是十分必要的。研究證實許多具有心肌保護的藥物通過多種信號通路最后聚集在糖原合酶激酶（GSK）-3β這一靶點上，即增加GSK-3β位點9絲氨酸（Ser9）的磷酸化，抑制其活

5、性降低線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）開放保護心肌，然而GSK-3β是否通過其他機制影響再灌注損傷仍不清楚。最新研究證實GSK-3β也調(diào)節(jié)炎癥如增強NF-κB活性，因此GSK-3β成為治療I/R和炎癥性疾病的新靶點。但是，在MI/R過程中，應(yīng)用GSK-3β抑制劑TDZD-8抑制其活性是否具有抗炎和免疫作用及其涉及的機制，尚需進一步深入研究。
　　因此，本研究的實驗?zāi)康模?br>　　1．明確GSK-3β抑制劑TDZD-8治療能否抑制M

6、I/R中炎性因子的產(chǎn)生，減輕MI/R病理損傷過程中的炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮抗炎作用。
　　2．如果是，進一步探討GSK-3β抑制劑TDZD-8作用的具體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，尤其是p38MAPK和NF-κB分子在其中的作用。
　　3．確定GSK-3β抑制劑TDZD-8能否下調(diào)再灌注激活的TLR2/NF-κB信號通路活性。
　　4.研究GSK-3β抑制劑的上述抗炎和抑制免疫效應(yīng)是否最終有助于減少I/R導(dǎo)致的細胞凋亡和心梗范圍，從而發(fā)

7、揮顯著的心臟保護作用。
　　實驗方法
　　1．雄性SD大鼠，腹腔麻醉后，開胸選擇性結(jié)扎冠狀動脈左室支，制備心肌I/R大鼠模型。分離股動脈并插管記錄動脈壓，分離頸靜脈建立靜脈通路。缺血30min，再灌注6h，再灌注開始后封閉胸腔，恢復(fù)動物自主呼吸。再灌注前5min頸靜脈推注不同濃度TDZD-8（0.1，1mg/kg）。I/R術(shù)中通過八道生理記錄儀持續(xù)記錄大鼠心電圖、心率、動脈壓及左室內(nèi)壓等血流動力學(xué)指標；分別于缺血前、缺血30

8、min、再灌注2h、6h由尾靜脈取血，測血糖水平；再灌注6h后由頸動脈取血2ml，分光光度法檢測血清肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH）活性。
　　2．動物模型的制作同第一部分。再灌注前5min分別靜脈推注二甲基亞砜（DMSO）或TDZD-8（1mg/kg）。再灌注6h后采用DAPI細胞核標記和末端脫氧核苷基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP原位平端標記法（TUNEL）復(fù)染定性和定量檢測心肌細胞凋亡指數(shù)（AI）。AI以TUNEL陽性細胞數(shù)占總

9、細胞計數(shù)的百分比表示；采用伊文藍－TTC雙染法測定心肌梗死范圍（IS），IS以心臟梗死范圍(INF)占缺血區(qū)面積(AAR)的百分比表示（INF/AAR×100％）；留取心肌組織，用ELISA試劑盒檢測組織TNF-α和IL-6的含量；分光光度法檢測心肌髓過氧化物酶（MPO）活性；再灌注30min后采用WesternBlot方法測定缺血心肌組織NF-κBp65,p38MAPK，GSK-3βSer9磷酸化蛋白含量，以檢測其活性。
　　3

10、．動物模型的制作同第一部分，應(yīng)用實時熒光定量（RT）-PCR觀察再灌注不同時間點（1h-24h）TLR2mRNA；免疫組織化學(xué)檢測再灌注12h后TLR2在心臟組織中定位情況。于再灌注前5min靜脈推注TDZD-8（1mg/kg），觀察再灌注1h后TLR2mRNA和下游炎癥因子TNF-α和IL-6mRNA變化及兩者相關(guān)性；WesternBlot方法測定缺血心肌組織NF-κBp65磷酸化蛋白含量及與TLR2mRNA相關(guān)性；采用伊文藍－TTC

11、雙染法測定心肌梗死范圍（IS）。
　　實驗結(jié)果
　　1.各組間心率在缺血期和再灌注期均不存在顯著性差異，各組動脈壓在缺血期間較假手術(shù)組下降（P<0.05），再灌注期間無差異。I/R組室內(nèi)收縮壓（LVSP）及其微分（±dP/dtmax）均出現(xiàn)降低，左室舒張末壓（LVEDP）升高，有顯著差異（P<0.01）。TDZD-8小劑量LVSP未見變化。與I/R組相比，TDZD-8大劑量組LVSP明顯增高（P<0.05），LVEDP及±d

12、P/dtmax均明顯改善（P<0.05）。CK和LDH活性反映心肌損傷程度。二者在大劑量TDZD-8組顯著降低（P<0.05）。提示再灌注時給予大劑量TDZD-8不影響血糖水平的改變而減輕再灌注心肌損傷并且增強心功能。
　　2.再灌注期給予TDZD-8發(fā)揮顯著的抗心肌細胞凋亡作用，細胞凋亡率從22％降到12％（P<0.05）；MI/R大鼠心肌梗死面積明顯增加，再灌注時給予TDZD-8心肌梗死面積從58％降到34％（P<0.05）。

13、TDZD-8單獨應(yīng)用并未影響心肌梗死面積和細胞凋亡。
　　3.與假手術(shù)組相比，缺血30min再灌注6h導(dǎo)致心肌組織中TNF-α，IL-6生成及MPO（反映中性粒細胞的浸潤水平）大量增加。與MI/R組相比，給予TDZD-8顯著減少心肌TNF-α，IL-6生成，分別從165.5pg/mgprotein，44.7pg/mgprotein降到107.4pg/mgprotein和29.28pg/mgprotein（P<0.05），同時TDZ

14、D-8降低心肌MPO活性，從36.40U/100mgtissue降到21.80U/100mgtissue（P<0.05）。這些結(jié)果提示再灌注時給予TDZD-8可抑制減輕心肌組織局部的炎癥反應(yīng)。
　　4.再灌注30min使缺血心肌的NF-κBp65磷酸化增加3.4倍，p38MAPK磷酸化增加4倍，GSK-3βSer9磷酸化水平下降，而TDZD-8抑制MI/R誘導(dǎo)的NF-κBp65、p38MAPK磷酸化阻斷其活化（P<0.05），增加

15、GSK-3βSer9磷酸化（P<0.05）。
　　5.TLR2mRNA隨著再灌注時間（1h-24h）的延長逐漸升高。1,6,12和24hTLR2mRNA分別是較假手術(shù)組TLR2mRNA的2.1-,2.9-,4.7-和3.5-倍（P<0.001），12hTLR2mRNA達到最高點；免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)再灌注12h后缺血區(qū)相鄰的2個或多個心肌細胞膜TLR2呈團簇樣表達，提示再灌注激活固有免疫系統(tǒng)。
　　6.再灌注1h后相關(guān)性分析

16、TLR2mRNA表達與NF-κBp65活化顯著相關(guān)(r=0.89,P<0.001)，與TNF-α，IL-6呈正相關(guān)(分別為:r=0.65;r=0.68,P<0.05)。TDZD-8處理顯著降低TLR2mRNA和TNF-α、IL-6mRNA(分別從2.1-，4.5-，4.3-倍降到1.5-，3.0-，2.7-倍,P<0.05)；NF-κBp65磷酸化蛋白含量較對照組明顯下降(P<0.05)；心肌梗死面積較MI/R組下降約33％(P<0.0

17、5)。
　　結(jié)論
　　1.TDZD-8通過增加GSK-3βSer9磷酸化而降低NF-κB和p38MAPK活性，減少再灌注心肌TNF-α、IL-6生成，抑制心肌中性粒細胞的浸潤，減輕心肌損傷（心肌梗死面積和細胞凋亡），改善左室功能，保護心肌。
　　2．再灌注引起固有免疫系統(tǒng)TLR2功能性表達，TDZD-8降低再灌注后TLR2表達及其信號通路而保護心肌。
　　3．上述結(jié)果提示GSK-3β抑制劑TDZD-8心血管保護的