GSK-3β抑制劑對(duì)大鼠心臟缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　缺血性心臟?。↖HD）是當(dāng)今世界威脅人類健康的首敵。隨著冠狀動(dòng)脈內(nèi)溶栓及冠脈搭橋等內(nèi)外科治療手段的廣泛應(yīng)用，繼之出現(xiàn)的心肌細(xì)胞再灌注損傷日益受到心臟病學(xué)家的高度重視。來(lái)自動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察的證據(jù)表明，心臟缺血再灌注（MI/R）后局部組織過(guò)度的炎癥反應(yīng)是造成再灌注損傷的主要原因之一，也是心臟缺血繼發(fā)性損傷的重要病理生理機(jī)制。多項(xiàng)研究證實(shí)，p38絲裂原活化蛋白激酶（p38-MAPK)和核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）是各

2、器官I/R炎癥損傷中密切相關(guān)的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，并對(duì)炎癥介質(zhì)如TNF-α、IL-1β、IL-6和黏附分子（ICAM-1、VCAM-1）等的表達(dá)及凋亡細(xì)胞的調(diào)控發(fā)揮著重要作用。因此，藥物預(yù)處理下調(diào)p38MAPK和NF-κB的活性，有望成為控制TNF-α等表達(dá)的策略，從而減輕MI/R炎性損傷。
　　研究認(rèn)為急性期MI/R損傷是固有免疫應(yīng)答的一部分，而導(dǎo)致這種非感染刺激炎癥應(yīng)答的機(jī)制部分是通過(guò)Toll樣受體（TLRs）介導(dǎo)的信號(hào)。TLRs在

3、心肌細(xì)胞的表達(dá)不但對(duì)心肌細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥應(yīng)答帶來(lái)新的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也提供降低MI/R損傷的靶點(diǎn)。TLRs在缺血性心臟損傷中的作用研究才剛剛起步，目前和心臟缺血關(guān)系比較明確是TLR2和TLR4。TLR2和TLR4均可以識(shí)別缺血中損傷釋放的內(nèi)源性“危險(xiǎn)信號(hào)”，這為TLRs和心臟缺血的關(guān)系研究提供了理論依據(jù)。MI/R增加TLR4mRNA和蛋白表達(dá)，TLR4激活下游MAPK、NF-κB等活性，隨后炎癥因子瀑布表達(dá)，引起心肌損傷。但在MI/R中TLR2表

4、達(dá)情況仍不清楚，藥物是否能降低心臟TLR2信號(hào)通路減輕炎性損傷的研究也未見報(bào)道。
　　目前，再灌注治療顯著促進(jìn)急性心肌梗死(AMI)患者的預(yù)后，然而，將近25％患者再灌注治療不能提供足夠的存活心肌，而導(dǎo)致嚴(yán)重心力衰竭，故尋找安全有效的抗心肌缺血再灌注損傷藥物和方法是十分必要的。研究證實(shí)許多具有心肌保護(hù)的藥物通過(guò)多種信號(hào)通路最后聚集在糖原合酶激酶（GSK）-3β這一靶點(diǎn)上，即增加GSK-3β位點(diǎn)9絲氨酸（Ser9）的磷酸化，抑制其活

5、性降低線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）開放保護(hù)心肌，然而GSK-3β是否通過(guò)其他機(jī)制影響再灌注損傷仍不清楚。最新研究證實(shí)GSK-3β也調(diào)節(jié)炎癥如增強(qiáng)NF-κB活性，因此GSK-3β成為治療I/R和炎癥性疾病的新靶點(diǎn)。但是，在MI/R過(guò)程中，應(yīng)用GSK-3β抑制劑TDZD-8抑制其活性是否具有抗炎和免疫作用及其涉及的機(jī)制，尚需進(jìn)一步深入研究。
　　因此，本研究的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　1．明確GSK-3β抑制劑TDZD-8治療能否抑制M

6、I/R中炎性因子的產(chǎn)生，減輕MI/R病理?yè)p傷過(guò)程中的炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮抗炎作用。
　　2．如果是，進(jìn)一步探討GSK-3β抑制劑TDZD-8作用的具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，尤其是p38MAPK和NF-κB分子在其中的作用。
　　3．確定GSK-3β抑制劑TDZD-8能否下調(diào)再灌注激活的TLR2/NF-κB信號(hào)通路活性。
　　4.研究GSK-3β抑制劑的上述抗炎和抑制免疫效應(yīng)是否最終有助于減少I/R導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡和心梗范圍，從而發(fā)

7、揮顯著的心臟保護(hù)作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法
　　1．雄性SD大鼠，腹腔麻醉后，開胸選擇性結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左室支，制備心肌I/R大鼠模型。分離股動(dòng)脈并插管記錄動(dòng)脈壓，分離頸靜脈建立靜脈通路。缺血30min，再灌注6h，再灌注開始后封閉胸腔，恢復(fù)動(dòng)物自主呼吸。再灌注前5min頸靜脈推注不同濃度TDZD-8（0.1，1mg/kg）。I/R術(shù)中通過(guò)八道生理記錄儀持續(xù)記錄大鼠心電圖、心率、動(dòng)脈壓及左室內(nèi)壓等血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)；分別于缺血前、缺血30

8、min、再灌注2h、6h由尾靜脈取血，測(cè)血糖水平；再灌注6h后由頸動(dòng)脈取血2ml，分光光度法檢測(cè)血清肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH）活性。
　　2．動(dòng)物模型的制作同第一部分。再灌注前5min分別靜脈推注二甲基亞砜（DMSO）或TDZD-8（1mg/kg）。再灌注6h后采用DAPI細(xì)胞核標(biāo)記和末端脫氧核苷基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP原位平端標(biāo)記法（TUNEL）復(fù)染定性和定量檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）。AI以TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總

9、細(xì)胞計(jì)數(shù)的百分比表示；采用伊文藍(lán)－TTC雙染法測(cè)定心肌梗死范圍（IS），IS以心臟梗死范圍(INF)占缺血區(qū)面積(AAR)的百分比表示（INF/AAR×100％）；留取心肌組織，用ELISA試劑盒檢測(cè)組織TNF-α和IL-6的含量；分光光度法檢測(cè)心肌髓過(guò)氧化物酶（MPO）活性；再灌注30min后采用WesternBlot方法測(cè)定缺血心肌組織NF-κBp65,p38MAPK，GSK-3βSer9磷酸化蛋白含量，以檢測(cè)其活性。
　　3

10、．動(dòng)物模型的制作同第一部分，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量（RT）-PCR觀察再灌注不同時(shí)間點(diǎn)（1h-24h）TLR2mRNA；免疫組織化學(xué)檢測(cè)再灌注12h后TLR2在心臟組織中定位情況。于再灌注前5min靜脈推注TDZD-8（1mg/kg），觀察再灌注1h后TLR2mRNA和下游炎癥因子TNF-α和IL-6mRNA變化及兩者相關(guān)性；WesternBlot方法測(cè)定缺血心肌組織NF-κBp65磷酸化蛋白含量及與TLR2mRNA相關(guān)性；采用伊文藍(lán)－TTC

11、雙染法測(cè)定心肌梗死范圍（IS）。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.各組間心率在缺血期和再灌注期均不存在顯著性差異，各組動(dòng)脈壓在缺血期間較假手術(shù)組下降（P<0.05），再灌注期間無(wú)差異。I/R組室內(nèi)收縮壓（LVSP）及其微分（±dP/dtmax）均出現(xiàn)降低，左室舒張末壓（LVEDP）升高，有顯著差異（P<0.01）。TDZD-8小劑量LVSP未見變化。與I/R組相比，TDZD-8大劑量組LVSP明顯增高（P<0.05），LVEDP及±d

12、P/dtmax均明顯改善（P<0.05）。CK和LDH活性反映心肌損傷程度。二者在大劑量TDZD-8組顯著降低（P<0.05）。提示再灌注時(shí)給予大劑量TDZD-8不影響血糖水平的改變而減輕再灌注心肌損傷并且增強(qiáng)心功能。
　　2.再灌注期給予TDZD-8發(fā)揮顯著的抗心肌細(xì)胞凋亡作用，細(xì)胞凋亡率從22％降到12％（P<0.05）；MI/R大鼠心肌梗死面積明顯增加，再灌注時(shí)給予TDZD-8心肌梗死面積從58％降到34％（P<0.05）。

13、TDZD-8單獨(dú)應(yīng)用并未影響心肌梗死面積和細(xì)胞凋亡。
　　3.與假手術(shù)組相比，缺血30min再灌注6h導(dǎo)致心肌組織中TNF-α，IL-6生成及MPO（反映中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)水平）大量增加。與MI/R組相比，給予TDZD-8顯著減少心肌TNF-α，IL-6生成，分別從165.5pg/mgprotein，44.7pg/mgprotein降到107.4pg/mgprotein和29.28pg/mgprotein（P<0.05），同時(shí)TDZ

14、D-8降低心肌MPO活性，從36.40U/100mgtissue降到21.80U/100mgtissue（P<0.05）。這些結(jié)果提示再灌注時(shí)給予TDZD-8可抑制減輕心肌組織局部的炎癥反應(yīng)。
　　4.再灌注30min使缺血心肌的NF-κBp65磷酸化增加3.4倍，p38MAPK磷酸化增加4倍，GSK-3βSer9磷酸化水平下降，而TDZD-8抑制MI/R誘導(dǎo)的NF-κBp65、p38MAPK磷酸化阻斷其活化（P<0.05），增加

15、GSK-3βSer9磷酸化（P<0.05）。
　　5.TLR2mRNA隨著再灌注時(shí)間（1h-24h）的延長(zhǎng)逐漸升高。1,6,12和24hTLR2mRNA分別是較假手術(shù)組TLR2mRNA的2.1-,2.9-,4.7-和3.5-倍（P<0.001），12hTLR2mRNA達(dá)到最高點(diǎn)；免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)再灌注12h后缺血區(qū)相鄰的2個(gè)或多個(gè)心肌細(xì)胞膜TLR2呈團(tuán)簇樣表達(dá)，提示再灌注激活固有免疫系統(tǒng)。
　　6.再灌注1h后相關(guān)性分析

16、TLR2mRNA表達(dá)與NF-κBp65活化顯著相關(guān)(r=0.89,P<0.001)，與TNF-α，IL-6呈正相關(guān)(分別為:r=0.65;r=0.68,P<0.05)。TDZD-8處理顯著降低TLR2mRNA和TNF-α、IL-6mRNA(分別從2.1-，4.5-，4.3-倍降到1.5-，3.0-，2.7-倍,P<0.05)；NF-κBp65磷酸化蛋白含量較對(duì)照組明顯下降(P<0.05)；心肌梗死面積較MI/R組下降約33％(P<0.0

17、5)。
　　結(jié)論
　　1.TDZD-8通過(guò)增加GSK-3βSer9磷酸化而降低NF-κB和p38MAPK活性，減少再灌注心肌TNF-α、IL-6生成，抑制心肌中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，減輕心肌損傷（心肌梗死面積和細(xì)胞凋亡），改善左室功能，保護(hù)心肌。
　　2．再灌注引起固有免疫系統(tǒng)TLR2功能性表達(dá)，TDZD-8降低再灌注后TLR2表達(dá)及其信號(hào)通路而保護(hù)心肌。
　　3．上述結(jié)果提示GSK-3β抑制劑TDZD-8心血管保護(hù)的