聯(lián)合應用ROCKⅡ及GSK-3β抑制劑對缺氧缺血腦損傷新生大鼠神經(jīng)元細胞骨架穩(wěn)定作用研究.pdf

1、目的：
　　本實驗以新生SD（Sprague Dawley）大鼠為研究對象，觀察分別應用Rho-GTP酶（ROCKII）抑制劑法舒地爾（Fasudil）、GSK-3β激酶抑制劑TDZD8以及兩者聯(lián)合應用對缺氧缺血腦損傷（Hypoxic Ischemic Brain Damage，HIBD）大鼠腦海馬組織神經(jīng)細胞形態(tài)、肌動蛋白相關通路（Rho/ROCK信號通路）以及微管蛋白相關通路（PI3K/AKT/GSK-3β信號通路）中重要蛋白

2、表達水平的變化，以及對細胞凋亡的影響，探討同時抑制影響軸突生長的兩個關鍵酶ROCKII和GSK-3β激酶，能否使肌動蛋白F-actin及微管蛋白β-tublin降解破壞減少，了解聯(lián)合用藥的神經(jīng)保護作用，為臨床上開發(fā)聯(lián)合用藥治療新生兒缺氧缺血性腦病提供實驗依據(jù)。
　　材料與方法：
　　采用出生7天SD大鼠，隨機分為正常組、假手術組、HIBD組、溶劑組、Fasudil組、TDZD8組、聯(lián)合用藥組。參照Rice方法制作HIBD模型

3、；Fasudil組、TDZD8組、聯(lián)合用藥組及溶劑組大鼠在制作HIBD模型后0h、24h、48h各腹腔給藥或生理鹽水（NS，normal saline）一次，72h處死，取大鼠腦海馬組織，HE染色觀察組織細胞形態(tài)學變化；Western Blot檢測海馬組織ROCKII、F-actin、p-GSK-3β、β-tubulin蛋白表達量；TUNEL染色檢測海馬組織細胞凋亡情況。實驗結果采用SPSS for Windows21.0統(tǒng)計軟件進行資

4、料分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x?s_）表示，采用單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，若方差為齊性，組間兩兩比較以Scheffe方法分析；若方差不齊，以Dunnett T3方法分析。P<0.05為差別有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.HE染色觀察各組海馬組織神經(jīng)細胞形態(tài)
　　正常組及假手術組細胞結構較清晰、排列有序，組織細胞間隙正常，細胞核清晰可見，胞漿染色均勻

5、。HIBD組及溶劑組細胞結構不清，可見細胞胞體腫脹呈氣球樣變，神經(jīng)元數(shù)目減少，部分區(qū)域可見細胞核固縮等壞死性改變及神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生。Fasudil及TDZD8干預組細胞形態(tài)有所改善，但密度仍較正常組減低，少部分區(qū)域可見細胞出現(xiàn)皺縮改變。聯(lián)合用藥組細胞組織結構基本完整，大部分細胞核清晰可見，神經(jīng)細胞的壞死及變性程度較HIBD組明顯減輕。
　　2.TUNLE染色檢測各組海馬組織神經(jīng)細胞凋亡情況
　　正常組、假手術組、HIBD組、

6、溶劑組、Fasudil組、TDZD8組、聯(lián)合用藥組細胞凋亡率分別為：9.27±1.48，12.31±1.65，65.14±3.74，68.79±3.26，47.31±2.95，45.58±2.42，14.27±1.51（P<0.05）；Fasudil組及TDZD8組均較HIBD組相比細胞凋亡減少（P<0.05），但仍低于正常組（P<0.05），而聯(lián)合用藥組能較顯著改善細胞凋亡情況，與正常組對比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　

7、　3.Western Blot方法檢測肌動蛋白、微管蛋白及其上游蛋白表達情況
　　HIBD組海馬組織F-actin及β-tubulin蛋白量均明顯低于正常組（P<0.05）；分別給予藥物Fasudil或TDZD8干預后，細胞骨架蛋白降解減少，F(xiàn)-actin及β-tubulin蛋白表達有所增加，其中，β-tubulin蛋白表達與HIBD組相比有差異（P<0.05）,而F-actin與HIBD組相比無統(tǒng)計學差異（P>0.05）；聯(lián)合用

8、藥組F-actin及β-tubulin蛋白表達較分別給藥時增加更明顯，與HIBD組相比有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。同時，HIBD組ROCKII蛋白表達明顯高于正常組（ P<0.05）， p-GSK-3β蛋白表達明顯低于正常組（ P<0.05），推測Rho/ROCK及AKT/GSK-3β兩條信號通路參與細胞骨架降解過程，同時使用兩條通路的抑制劑可通過減少細胞骨架蛋白的降解，穩(wěn)定神經(jīng)元細胞骨架，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
　　結論：