14-3-3gamma對神經(jīng)元缺氧缺血損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、14-3-3蛋白是1967年從牛腦中分離出，有7個亞型，它高度保守，廣泛存在于真核生物中。其中beta，epsilon，eta，gamma，zeta在腦組織中含量十分豐富。14-3-3gamma主要在神經(jīng)元表達。我們曾報道14-3-3gamma在體外缺血培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞中表達上調(diào)，并且通過結(jié)合磷酸化Bad減少缺血誘導的膠質(zhì)細胞死亡。但是，14-3-3蛋白在神經(jīng)元中保護機制至今尚不清楚。
　　 目的：研究14-3-3蛋白在缺血損

2、傷的神經(jīng)元中的表達，保護作用和機制。
　　 方法：通過基因重組技術(shù)構(gòu)建14-3-3gamma干擾質(zhì)粒，運用LDH釋放實驗，Western blot，免疫熒光染色，免疫共沉淀以及原代神經(jīng)元核轉(zhuǎn)染等方法測定14-3-3gamma的表達，保護作用及機制研究，采用CoCl2誘導的缺氧預適應方法研究在體14-3-3蛋白的保護作用。
　　 結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經(jīng)元缺血處理后14-3-3gamma表達明顯增加。而14

3、-3-3beta，epsilon，eta和zeta在相同處理下沒有明顯的變化。過度表達14-3-3特異結(jié)合蛋白（Diforpein）導致小鼠神經(jīng)瘤母細胞（N2a）和原代神經(jīng)元死亡增加。而過度表達14-3-3gamma顯著減少缺血誘導的N2a和原代神經(jīng)元的死亡。除此之外，我們在培養(yǎng)的N2a細胞和原代神經(jīng)元中加入特異降解14-3-3gamma的siRNA也增加缺血誘導的細胞死亡。為了明確14-3-3gamma在缺血性損傷中的保護機制，通過免

4、疫共沉淀方法，我們發(fā)現(xiàn)在原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經(jīng)元經(jīng)缺血處理后，14-3-3gamma上調(diào)并特異結(jié)合同時上調(diào)的絲氨酸37位點磷酸化beta-catenin，而它與Ask-1沒有明顯的相互作用。另外，我們還發(fā)現(xiàn)在過度表達14-3-3gamma的N2a細胞中，Bax的表達明顯下調(diào)；而過度表達14-3-3gamma-siRNA至內(nèi)源性14-3-3gamma下調(diào)時，Bax的表達增加。在氯化鈷誘導的缺氧預適應動物模型中，動物耐受缺氧存活時間明顯