吡咯喹啉醌對(duì)谷氨酸損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　1.觀察吡咯喹啉醌（PQQ）對(duì)體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元谷氨酸損傷的保護(hù)作用，并初步探討其作用機(jī)制。
　　2.觀察 PQQ對(duì)谷氨酸腦內(nèi)注射大鼠模型神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用，并分析其作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.體外培養(yǎng)胚胎大鼠海馬神經(jīng)元，神經(jīng)元特異性染色（MAP2）鑒定神經(jīng)元純度；通過(guò)CCK-8法檢測(cè)不同濃度PQQ（12.5μM、25μM、50μM、100μM）對(duì)正常培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響。
　　2

2、.建立原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元谷氨酸急性損傷模型（125μM，15 min），通過(guò)細(xì)胞形態(tài)觀察和CCK-8法，觀察PQQ對(duì)谷氨酸損傷海馬神經(jīng)元形態(tài)和細(xì)胞活力的影響。
　　3.通過(guò)Hoechst33342和TUNEL染色，觀察PQQ對(duì)谷氨酸損傷海馬神經(jīng)元凋亡的影響。
　　4.通過(guò)Western blot和Caspase-3酶活性檢測(cè)，觀察PQQ對(duì)谷氨酸損傷海馬神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)及凋亡相關(guān)蛋白酶Caspas

3、e-3活性的影響。
　　5.鈣離子熒光探針Fluo-4/AM標(biāo)記海馬神經(jīng)元，激光共聚焦顯微鏡下檢測(cè)PQQ對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流的影響。
　　6.通過(guò)TMRM染色，檢測(cè)PQQ對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元線粒體膜電位改變的影響。
　　7.通過(guò)活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）分析，觀察 PQQ對(duì)谷氨酸損傷神經(jīng)元氧自由基生成及清除的影響。
　　8.通

4、過(guò)線粒體氧化呼吸鏈不同復(fù)合物的抑制劑應(yīng)用，尋找PQQ在線粒體自由基清除中可能的作用靶點(diǎn)。
　　9.通過(guò)Western blot檢測(cè)Akt、GSK3β、JNK和P38蛋白磷酸化水平的表達(dá)變化，并加入相應(yīng)通路抑制劑，觀察各抑制劑對(duì)PQQ保護(hù)功能的影響，尋找PQQ保護(hù)作用相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
　　10.通過(guò)免疫熒光化學(xué)觀察PQQ對(duì)谷氨酸損傷海馬神經(jīng)元Nrf2表達(dá)定位的影響，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)PQQ對(duì)轉(zhuǎn)錄因子和抗氧化基因（Nrf1、

5、Nrf2、HO-1、GCLC）的表達(dá)影響，并觀察PI3K抑制劑的影響作用。
　　11.構(gòu)建谷氨酸腦內(nèi)注射模型，TUNEL檢測(cè)PQQ在體內(nèi)對(duì)大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，F(xiàn)CM分析PQQ對(duì)谷氨酸腦內(nèi)注射大鼠皮層細(xì)胞ROS生成的影響，并檢測(cè)SOD、GSH和MDA活性及含量的變化。
　　12.通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot檢測(cè)PQQ對(duì)谷氨酸腦內(nèi)注射大鼠皮層細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子和抗氧化基因（Nrf1、Nrf2、HO-1、GCLC

6、）表達(dá)及磷酸化 GSK3β表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1.原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元純度較高，達(dá)95％以上，0~100μM濃度范圍內(nèi)PQQ對(duì)正常培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞活力沒(méi)有顯著影響。
　　2. PQQ對(duì)谷氨酸損傷的海馬神經(jīng)元具有保護(hù)作用，能抑制細(xì)胞活力的下降和減少細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生，并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)效應(yīng)，在濃度為100μM時(shí)作用最佳。
　　3. PQQ能調(diào)節(jié)谷氨酸損傷海馬神經(jīng)元中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的比例，降低凋亡蛋

7、白酶Caspase-3的活性。
　　4. PQQ能穩(wěn)定線粒體膜電位，減少谷氨酸誘導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流。
　　5. PQQ通過(guò)抑制谷氨酸損傷神經(jīng)元中ROS的生成及增加ROS的清除，減少氧化應(yīng)激損傷。
　　6.線粒體復(fù)合物I、III和IV抑制劑能增加海馬神經(jīng)元中ROS的生成，PQQ能減少?gòu)?fù)合物I和III抑制劑誘導(dǎo)的ROS增加，提示其作用靶點(diǎn)可能位于復(fù)合物I和III。
　　7. PQQ能維持谷氨酸損傷神經(jīng)元中Akt的持續(xù)活

8、化并激活其下游GSK3β信號(hào)，同時(shí)抑制JNK信號(hào)的激活。使用PI3K抑制劑可以阻斷PQQ對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用及對(duì)凋亡蛋白比例的調(diào)節(jié)。
　　8. PQQ能促進(jìn)Nrf2的核轉(zhuǎn)位和表達(dá)，增加下游ARE依賴(lài)抗氧化基因HO-1和GCLC的表達(dá)，這種作用可以被PI3K抑制劑所抑制。
　　9. PQQ對(duì)谷氨酸腦內(nèi)注射大鼠具有保護(hù)作用，可以減少注射周?chē)蛹?xì)胞凋亡的發(fā)生和降低大腦皮層細(xì)胞ROS的含量。
　　10. PQQ能促進(jìn)谷氨酸腦內(nèi)

9、注射大鼠大腦皮層內(nèi)Nrf2、HO-1和GCLC的表達(dá)，增加磷酸化GSK3β的表達(dá)，這可能與其保護(hù)功能相關(guān)。
　　結(jié)論：PQQ對(duì)體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元谷氨酸損傷具有保護(hù)作用，能調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的比例及蛋白酶活性從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。PQQ在體內(nèi)也能拮抗谷氨酸誘導(dǎo)的大腦皮層細(xì)胞凋亡。PQQ的保護(hù)作用可能與穩(wěn)定線粒體功能、減少Ca2+超載、降低 ROS損傷和增加抗氧化基因的表達(dá)相關(guān)。PI3K/Akt/GSK3β信號(hào)途徑的活化在PQQ的保