BDNF對(duì)谷氨酸引起的皮層神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及對(duì)NMDA受體表達(dá)的影響.pdf

1、目的：觀察谷氨酸對(duì)體外原代培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元損傷作用，研究腦源性生長(zhǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）對(duì)谷氨酸損傷的神經(jīng)元保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制，探討B(tài)DNF對(duì)損傷神經(jīng)元的N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR）表達(dá)的影響。
　　方法：1、體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元分為A組：正常對(duì)照組；B組:谷氨酸組、C組:BDNF組。

2、A組：第7天的皮層神經(jīng)元經(jīng)原培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)；B組：第7天的皮層神經(jīng)元加入50μmol/L的谷氨酸，作用30分鐘后改為原培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)；C組：第6天的皮層神經(jīng)元通過(guò)50ng/ml BDNF孵育24小時(shí)后，經(jīng)50μmol/L谷氨酸作用30分鐘，再改為原培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)。然后應(yīng)用MTT檢測(cè)三組皮層神經(jīng)元的損傷程度，運(yùn)用共聚焦顯微鏡檢測(cè)三組皮層神經(jīng)元內(nèi)鈣離子水平。
　　2、體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元分為A1組即空白對(duì)照組、B1

3、組即對(duì)照組、C1組即谷氨酸組、D1組即BDNF組、E1組即BDNF拮抗組（K252a組）。其中A1組：培養(yǎng)7天的皮層神經(jīng)元繼續(xù)原培養(yǎng)基培養(yǎng)；B1組：培養(yǎng)第6天的皮層神經(jīng)元經(jīng)50ng/mlBDNF孵育24小時(shí)后原培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；C1組：第7天的皮層神經(jīng)元加入50μmol/L的谷氨酸，作用30分鐘后改為原培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；D1組：培養(yǎng)第6天的皮層神經(jīng)元經(jīng)50ng/mlBDNF孵育24小時(shí)后再加入50μmol/L的谷氨酸，作用30分鐘后改為原培

4、養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；E1組：培養(yǎng)第6天的皮層神經(jīng)元經(jīng)50ng/ml BDNF+K252a孵育24小時(shí)后加入50μmol/L的谷氨酸，作用30分鐘后改為原培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)分別收集五組神經(jīng)元細(xì)胞，運(yùn)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)NMDAR1mRNA在五組皮層神經(jīng)元的表達(dá)情況。通過(guò)western blot了解NMDAR1蛋白在各組皮層神經(jīng)元表達(dá)情況，在谷氨酸受體激動(dòng)劑NMDA刺激下應(yīng)用共聚焦顯微鏡初步檢測(cè)各組皮層神經(jīng)元NM

5、DAR受體的活性。
　　結(jié)果：1、與正常對(duì)照組（0.8170±0.0323）相比，谷氨酸組存活率（0.7126±0.0320）明顯降低；與谷氨酸組相比，BDNF組（0.7858±0.0219）可以提高細(xì)胞存活率。
　　2、在共聚焦顯微鏡下，谷氨酸組皮層神經(jīng)元[Ca2+]i（128.1±2.5）、BDNF組皮層神經(jīng)元[Ca2+]i（125.8±3.5）較正常對(duì)照組皮層神經(jīng)元[Ca2+]i（112.4±2.0）高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

6、義（p<0.05)。
　　3、與C1組（谷氨酸組）相比，NMDAR1 mRNA在D1組（BDNF組）及B1組（對(duì)照組）中6小時(shí)的轉(zhuǎn)錄明顯上升，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05)，24小時(shí)轉(zhuǎn)錄量無(wú)差異（p＞0.05)，E1組（K252a組）中各時(shí)間段NMDAR1mRNA轉(zhuǎn)錄量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05)。與B1組（對(duì)照組）相比，D1組（BDNF組）各時(shí)間段NMDAR1mRNA轉(zhuǎn)錄量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）。
　　4、與A1組（空

7、白對(duì)照組）相比，B1組（對(duì)照組）NMDAR1蛋白在6h、12h表達(dá)明顯升高，24h降低，但仍高于A1組（空白對(duì)照組），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05)。NMDAR1蛋白在B1組（對(duì)照組）、D1組（BDNF組）各時(shí)間段的表達(dá)量較C1組（谷氨酸組）及E1組（K252a組）升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05)。D1組（BDNF組）中24h較6h、12h表達(dá)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05)。D1組（BDNF組）與B1組（對(duì)照組）各時(shí)間

8、段表達(dá)量無(wú)差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05)。C1組（谷氨酸組）與E1組（K252a組）各時(shí)間段表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05)。在NMDA刺激下，30s后B1組（對(duì)照組）、D1組（BDNF組）細(xì)胞[Ca2+]i較C1組（谷氨酸組）和E1組（K252a組）顯著升高。
　　結(jié)論：1、BDNF對(duì)谷氨酸損傷的神經(jīng)元具有保護(hù)作用，其機(jī)制并非通過(guò)減少損傷神經(jīng)元[Ca2+]i來(lái)降低神經(jīng)元損傷。
　　2、BDNF可增加谷氨酸損傷皮層神經(jīng)