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文檔簡介
1、目的:
建立谷氨酸(GlutamateGlu)誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷模型,觀察雌激素及雌激素受體a(EstrongenreceptoraERa)對谷氨酸誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,分析其可能作用機(jī)制,希望為進(jìn)一步認(rèn)識神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的病理生理過程提供理論依據(jù),并為相關(guān)領(lǐng)域的治療提供新的思路。
方法:
原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)細(xì)胞,神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuronspecificenolase,NSE)免疫組化染色方法
2、鑒定神經(jīng)元的純度。建立Glu誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷模型,通過檢測細(xì)胞乳酸脫氫酶(Lactatedehydrogenase,LDH)漏出率以及細(xì)胞凋亡率,鑒定該損傷模型。用前期試驗(yàn)中已構(gòu)建成功的ERα重組慢病毒(V-ERa-RFP-flag),感染Glu誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷模型,實(shí)時(shí)熒光定量PCR和westernblot方法檢測ERα轉(zhuǎn)錄和蛋白相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)分為3組:①對照組:空慢病毒(V-RFP-flag)感染Glu誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷模型
3、;②雌激素組:雌激素干預(yù)Glu誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷模型;③慢病毒組:V-ERa-RFP-flag感染Glu誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷模型。通過流式細(xì)胞儀(Flowcytomety,F(xiàn)CM)、酶標(biāo)儀分別檢測各組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率、LDH漏出率以及Caspase3活性,觀察對比神經(jīng)細(xì)胞損傷程度;實(shí)時(shí)熒光定量PCR及免疫熒光法檢測各組神經(jīng)細(xì)胞中N-甲基-D-天氡氨酸受體1(N-methyl-D-asprtatereceptor1,NMDAR1)及Ⅰ型囊泡膜
4、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(VesicularGlutamateTransporteroftype1,VGLUT1)變化。
結(jié)果:
成功原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞,經(jīng)NSE免疫組化方法鑒定神經(jīng)元純度大于90%。Glu誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷模型中神經(jīng)細(xì)胞凋亡率為20.68±5.6,LDH漏出率為28.9±2.6,與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),該模型構(gòu)建成功。Mol=7的V-ERa-RFP-flag感染神經(jīng)細(xì)胞72h后,在熒光顯微鏡
5、觀察下可見到紅色熒光表達(dá),與對照病毒相比,能增加神經(jīng)細(xì)胞中ERα轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平(P<0.001)。與對照組相比,雌激素組、慢病毒組細(xì)胞凋亡率、LDH漏出率、Caspase3活性均降低(P<0.05),且實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,雌激素組和慢病毒組NMDAR1和VGLUT1基因轉(zhuǎn)錄均下調(diào)(P<0.05),免疫熒光結(jié)果提示NMDAR1和VGLUT1陽性細(xì)胞數(shù)減少(P<0.01)。
結(jié)論:
原代培養(yǎng)小鼠神經(jīng)細(xì)胞,成功
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