雌激素延緩衰老及植物雌激素α-ZAL抗Aβ細(xì)胞損傷作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、衰老的發(fā)生和演變是生物體不可抗拒的自然過程，隨著老年醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展，有關(guān)衰老機(jī)制的學(xué)說已有上百種，但至今對(duì)衰老是如何發(fā)生的仍無確切答案。近年研究人員發(fā)現(xiàn)：伴隨自然衰老過程，活性氧產(chǎn)物生成增多超過機(jī)體清除能力，可致細(xì)胞及生物大分子受損，其中對(duì)核酸的損害主要表現(xiàn)為DNA氧化受損和修復(fù)不足，損傷DNA積累激發(fā)變異信號(hào)誘導(dǎo)性衰老，最終啟動(dòng)衰老過程。減輕DNA損傷，促進(jìn)損傷修復(fù)必然有利于衰老過程的延緩。作為一種內(nèi)源性激素，雌激素表現(xiàn)出的延緩自然衰

2、老的作用已被流行病學(xué)研究證實(shí)，但它對(duì)衰老過程中細(xì)胞DNA的損傷修復(fù)是否具有影響，尚未見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究設(shè)計(jì)了體內(nèi)、外試驗(yàn)，觀察衰老過程中雌激素作用下DNA損傷修復(fù)的變化，探討其可能的延緩衰老作用機(jī)制。 伴隨衰老進(jìn)程，神經(jīng)退行性疾病-阿爾茨海默病(Alzheimers disease，AD)的發(fā)病率呈增高趨勢(shì)。在AD的發(fā)病中，β-淀粉樣蛋白(Aβ)的生成、代謝及毒性作用是AD發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是AD神經(jīng)元丟失

3、的主要原因，因而拮抗Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是預(yù)防AD的重要靶標(biāo)。雌激素預(yù)防AD的作用已得到實(shí)驗(yàn)的證實(shí)，但植物雌激素-α-玉米赤霉烯醇(α-Zearalanol，α-ZAL)是否具有類似效應(yīng)，迄今未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以雌激素為陽(yáng)性對(duì)照，觀察α-ZAL的抗Aβ?lián)p傷作用，在細(xì)胞水平評(píng)價(jià)α-ZAL的神經(jīng)保護(hù)作用，為開發(fā)新的安全有效的激素替代藥物奠定基礎(chǔ)。 第一部分雌激素減輕DNA氧化損傷，延緩衰老一、體外實(shí)驗(yàn)1.應(yīng)用有限增殖細(xì)胞-人胚肺二倍

4、體成纖維細(xì)胞(human diploid fibroblasts，HDF)體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)以無E2血清培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)50次群體倍增(PD50)后即完全進(jìn)入衰老狀態(tài)，而從PD30開始加入E2(10-8、10-7、10-6)持續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞分別經(jīng)54、57、59次群體倍增后才進(jìn)入完全衰老狀態(tài)，表明雌激素具有延長(zhǎng)細(xì)胞生命周期的作用，且作用表現(xiàn)出一定的劑量依賴關(guān)系。 2.在PD50時(shí)，10-6M E2培養(yǎng)細(xì)胞中β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯

5、少于無E2培養(yǎng)對(duì)照細(xì)胞(P<0.05)。表明雌激素可延緩衰老表型的出現(xiàn)，有確實(shí)的抗衰老作用。 3.通過DCFH-DA免疫熒光染色觀察到，伴隨PD次數(shù)的增加，細(xì)胞內(nèi)源性ROS水平升高，而10-6M E2可以減緩該升高過程。表明雌激素可以促進(jìn)活性氧產(chǎn)物的清除。 4.Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DNA損傷修復(fù)機(jī)制調(diào)控的重要因子p53和p21WAF1的表達(dá)受E2影響。在PD50時(shí)，10-6M E2培養(yǎng)細(xì)胞中p5

6、3和p21WAF1的表達(dá)低于對(duì)照細(xì)胞(P<0.05)，表明雌激素可明顯減少DNA損傷及其積累。 5.在PD50時(shí)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)10-6M E2培養(yǎng)條件下，細(xì)胞G1期細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；BrdU免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，10-6M E2培養(yǎng)細(xì)胞中BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照細(xì)胞(P<0.05)，表明雌激素可以維持DNA復(fù)制，延遲細(xì)胞周期阻滯的出現(xiàn)。 6.單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，

7、與200μM H2O2共孵育2h，細(xì)胞DNA明顯受損，細(xì)胞慧尾拉長(zhǎng)，而H2O2作用后加入10-6M E2，細(xì)胞慧尾長(zhǎng)度明顯短于單獨(dú)H2O2作用組(P<0.05)，表明雌激素可以明顯促進(jìn)DNA損傷修復(fù)。 二、在體實(shí)驗(yàn) 1.成年雌性C57小鼠隨機(jī)分為三組：對(duì)照組(Control)，假手術(shù)加皮下注射生理鹽水，腹腔注射芝麻油；模型組(Model)，雙側(cè)卵巢切除加皮下注射D-半乳糖100mg/kg.d和腹腔注射芝麻油；E2補(bǔ)充組(

8、ERT)，雙側(cè)卵巢切除加皮下注射D-半乳糖100mg/kg.d和腹腔注射E2 50μg/kg.d，D-半乳糖和E2連續(xù)使用8w。 2.MWM測(cè)試發(fā)現(xiàn)模型組小鼠尋臺(tái)潛伏期顯著長(zhǎng)于對(duì)照組(P<0.01)，而ERT組小鼠尋臺(tái)潛伏期短于模型小鼠(P<0.05)，該結(jié)果顯示雌激素補(bǔ)充可明顯改善小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。 3.比色法測(cè)定腦海馬抗氧化酶活力及MDA含量。結(jié)果表明，與對(duì)照組小鼠相比模型組小鼠MDA含量顯著升高(P<0.01)

9、，抗氧化酶SOD及GSH-Px活性顯著降低(P<0.01)，ERT組小鼠上述改變部分逆轉(zhuǎn)。 4.組織形態(tài)學(xué)表明，模型組小鼠海馬神經(jīng)元有明顯損傷，表現(xiàn)為海馬CA1區(qū)神經(jīng)元尼氏小體藍(lán)色顆粒減少和胞漿空泡樣變性，平均積分光密度值顯著低于對(duì)照組小鼠(P<0.01)，ERT組小鼠海馬CA1區(qū)尼氏小體增多，平均積分光密度值升高大于模型組小鼠(P<0.05)，表明雌激素可對(duì)抗D-半乳糖所致的神經(jīng)元損傷。 5.免疫組織化學(xué)及wester

10、n blotting結(jié)果顯示，模型組小鼠海馬神經(jīng)元DNA明顯受損，海馬CA1區(qū)DNA氧化損傷標(biāo)志物8-oxox-dG陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組小鼠(P<0.01)，而DNA損傷堿基切除修復(fù)蛋白MTH1及促DNA修復(fù)蛋白BDNF的表達(dá)均明顯降低(P<0.01)；ERT組小鼠CA1區(qū)8-oxox-dG陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少， MTH1及BDNF的表達(dá)明顯回升(P<0.05)。同時(shí)，ERT組小鼠應(yīng)激誘導(dǎo)的促DNA修復(fù)蛋白Hsp70的表達(dá)亦顯著高于模

11、型組(P<0.01)，表明雌激素可通過調(diào)節(jié)DNA修復(fù)機(jī)制來減少DNA氧化損傷。 6.末次注射BrdU后24h，模型小鼠海馬DG區(qū)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組顯著減少(P<0.01)，ERT組小鼠BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯多于模型組(P<0.05)，表明雌激素可保護(hù)小鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，有利于衰老細(xì)胞更新，延緩組織老化。 7.利用形態(tài)學(xué)及RT-PCR的方法，觀察小鼠子宮的相關(guān)變化，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠子宮顯著萎縮，E2補(bǔ)充后子宮

12、重量增加，但子宮內(nèi)膜癌標(biāo)志物MN/CA9 mRNA的表達(dá)在各組小鼠均未檢測(cè)到。表明在本實(shí)驗(yàn)條件下雌激素使用在保護(hù)神經(jīng)元的同時(shí)未使子宮產(chǎn)生異常變化。 本部分研究結(jié)果顯示，雌激素可通過減少內(nèi)源性活性氧產(chǎn)物的生成，調(diào)控DNA損傷修復(fù)蛋白表達(dá)，減輕DNA氧化損傷，促進(jìn)其損傷修復(fù)，從而減少由損傷DNA積累所啟動(dòng)的衰老程序而發(fā)揮延緩衰老作用。 第二部分植物雌激素α-玉米赤霉烯醇對(duì)PC12細(xì)胞Aβ25-35損傷的保護(hù)作用研究1.培養(yǎng)P

13、C12細(xì)胞，采用MTT方法觀察到，5μM Aβ25-35與細(xì)胞共孵育24h，活細(xì)胞數(shù)顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；而將細(xì)胞與不同濃度E2或α-ZAL預(yù)孵育12h后再加入Aβ25-35，活細(xì)胞數(shù)呈劑量依賴性的升高(P<0.05)，但在相同濃度下α-ZAL的細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)略低于E2。 2.透射電鏡結(jié)果顯示，5υM Aβ25-35與PC12細(xì)胞共孵育24h可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Hoechest33258熒光染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Aβ25-35作

14、用組凋亡細(xì)胞數(shù)顯著多于對(duì)照組(P<0.01)，E2及α-ZAL預(yù)孵育均明顯減輕Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(P<0.05)。 3.生化學(xué)檢測(cè)結(jié)果提示，與對(duì)照組相比，單獨(dú)Aβ25-35與PC12細(xì)胞共孵育，細(xì)胞MDA含量升高(P<0.01)，SOD和GSH-Px活性降低(P<0.01)，而E2及α-ZAL預(yù)孵育均能有效對(duì)抗Aβ25-35所致的細(xì)胞抗氧化酶活性降低及MDA生成增多(P<0.01)，表明。E2及α-ZAL可明顯對(duì)抗Aβ

15、25-35導(dǎo)致的細(xì)胞氧化損傷。 4.Western blotting及RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Aβ25-35導(dǎo)致PC12細(xì)胞抗凋亡蛋白be1-2表達(dá)減少，而促凋亡蛋白bax及caspase-3表達(dá)升高，E2及α-ZAL可拮抗上述改變。同時(shí)E2及α-ZAL還能誘導(dǎo)抗凋亡基因A20 mRNA的表達(dá)，表明E2及α-ZAL可通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白及基因的表達(dá)而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用。 本部分研究結(jié)果顯示，E2及α-ZAL均可通過對(duì)抗