懸浮培養(yǎng)大豆細(xì)胞高產(chǎn)植物雌激素成分的研究.pdf

1、更年期的婦女，由于卵巢功能減弱，雌激素分泌不足，容易導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、心血管疾病等更年期綜合癥的發(fā)生。采用雌激素替代療法可以緩解更年期綜合癥，雌激素通過調(diào)節(jié)平滑肌張力和脂代謝降低心血管疾病的發(fā)生，對(duì)心血管系統(tǒng)有保護(hù)作用。然而，長(zhǎng)期使用動(dòng)物雌激素有較大的副作用，會(huì)增加患子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。近年來研究發(fā)現(xiàn)異黃酮等植物次生代謝物具有與雌二醇相類似的結(jié)構(gòu)，能夠與雌激素受體結(jié)合，表現(xiàn)出雌激素樣作用，這類物質(zhì)稱為植物雌激素。和動(dòng)物雌激素(主要為雌

2、二醇)相比，植物雌激素對(duì)血管壁和生殖器官上的雌激素受體具有不同的選擇性結(jié)合能力，所以對(duì)生殖系統(tǒng)的副作用較小，不但能夠緩解婦女更年期綜合癥，而且會(huì)減少子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌的發(fā)病幾率。這一領(lǐng)域的研究為人類尋覓有效而安全的雌激素替代天然藥物提供了新的線索和思路。異黃酮類物質(zhì)大量存在于豆科植物及其產(chǎn)品中，但利用栽培資源植物提取該成分不僅需要占用大量耕地、植物生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，而且還要受地域和氣候等多種環(huán)境因素的限制。利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來生產(chǎn)植物代謝

3、產(chǎn)物則可以克服上述限制，為人類獲得天然物質(zhì)提供一條新途徑。 本文運(yùn)用組織培養(yǎng)技術(shù)，誘導(dǎo)了大豆愈傷組織，并建立了大豆懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系，從懸浮細(xì)胞中提取大豆異黃酮，有利于擴(kuò)大植物雌激素的來源。同時(shí)我們研究了異黃酮合成前體物苯丙氨酸(Phenylalanine，Phe)、次生物質(zhì)有效誘導(dǎo)子茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MJ)及蔗糖(Sucrose，S)和二甲亞砜(Dimethylsulfoxide，DMSO)對(duì)大豆懸浮

4、細(xì)胞中異黃酮積累的影響。主要包括以下幾個(gè)方面： 　　1.大豆種子經(jīng)消毒后，在培養(yǎng)基上萌發(fā)并長(zhǎng)出無菌苗，取其下胚軸為外植體誘導(dǎo)愈傷組織。誘導(dǎo)條件為：MS+2,4-D 0.8mg/L+瓊脂0.8％，暗中培養(yǎng)，溫度(25±1）℃。可在15天誘導(dǎo)出愈傷組織，白色或淡黃色，繼代培養(yǎng)后，建立了懸浮細(xì)胞系；以子葉為外植體，誘導(dǎo)愈傷組織，誘導(dǎo)條件為：MS+2,4-D5.0mg/L+瓊脂0.8％，暗中培養(yǎng)，溫度(25±1)℃，可在第5天誘導(dǎo)出愈傷

5、組織，塊大、細(xì)胞松散、白色或淡黃色，繼代培養(yǎng)后，可建立懸浮細(xì)胞系。 　　2.培養(yǎng)基中加入BA不利于子葉愈傷組織的形成；以下胚軸誘導(dǎo)愈傷時(shí)，BA的存在導(dǎo)致愈傷組織堅(jiān)硬，細(xì)胞致密，不利于形成懸浮細(xì)胞。 　　3.以每克干重計(jì)算，愈傷組織和懸浮細(xì)胞中的異黃酮含量均高于種子中。種子中總異黃酮含量為：1.55mg/g，懸浮細(xì)胞中總異黃酮含量為4.88mg/g，是種子的3.15倍?！　?.經(jīng)篩選確定：有利于大豆懸浮細(xì)胞中總異黃酮積累的

6、最佳培養(yǎng)條件為：MS+2,4-D 0.8mg/L，暗培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120r/min。 　　5.在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期(第6天)加入DMSO，48h后收獲細(xì)胞，有利于總異黃酮的積累，含量為7.54mg/g，是對(duì)照懸浮細(xì)胞總異黃酮含量的1.6倍，是種子總異黃酮含量的4.9倍；獲取大豆素的最佳培養(yǎng)條件為：45g/t，蔗糖作用于大豆素懸浮細(xì)胞72h；大豆懸浮細(xì)胞中加入10umol/L的苯丙氨酸不僅有利于大豆素積累，而且對(duì)染料木素的積累有一定作用，