四類植物雌激素對(duì)大鼠成骨細(xì)胞生物活性影響比較研究.pdf

1、目的:骨質(zhì)疏松癥(PMOP)是一種多病因的增齡性病變,它的主要臨床表現(xiàn)為腰背髖部疼痛,彎腰,駝背,身高變矮,輕微外傷就可以造成骨折。它基本病理機(jī)制是骨代謝過(guò)程中破骨細(xì)胞(OC)的骨吸收增加與成骨細(xì)胞(OB)的骨形成減少,從而導(dǎo)致人體內(nèi)的鈣磷代謝不平衡,骨密度(Bonemineral density,BMD)逐漸降低進(jìn)而形成骨質(zhì)疏松。骨質(zhì)疏松可以分為兩大類:絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松和老年性骨質(zhì)疏松。其中絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重,社會(huì)壓力大,已成為嚴(yán)

2、重的公共健康問(wèn)題。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)病與絕經(jīng)后雌激素分泌不足密切相關(guān),臨床上對(duì)絕經(jīng)后PMOP經(jīng)典的治療方法是雌激素替代療法(ERT),其療效肯定,但長(zhǎng)期應(yīng)用有增加冠心病、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等發(fā)生的副作用,因此尋找更為理想的化合物治療絕經(jīng)后PMOP成為人們亟待解決的問(wèn)題。近年來(lái)有報(bào)道稱植物雌激素(phytoestrogen,PE)可以有效預(yù)防PMOP,同時(shí)也不伴有ERT的并發(fā)癥。
　　 植物雌激素(phytoestrogen,PE

3、)是主要存在于植物、水果和蔬菜中的一類天然的,結(jié)構(gòu)及生物活性均類似于雌激素的非甾體類化合物,具有弱雌激素活性,為雜環(huán)多酚類化合物。PE可以與雌激素受體結(jié)合,對(duì)內(nèi)源性雌激素起雙向調(diào)節(jié)的作用,在改善圍絕經(jīng)期癥狀、降低血脂水平,防止骨質(zhì)疏松等方面起著有益作用。以切除卵巢的授乳大鼠模型做實(shí)驗(yàn),這些大鼠哺乳的幼鼠普遍存在骨量丟失,骨密度下降等癥狀。而喂養(yǎng)添加植物雌激素飼料的授乳幼鼠,骨密度明顯增高,說(shuō)明植物雌激素有預(yù)防骨質(zhì)疏松的作用。植物雌激素與

4、雌激素的作用相似,可與破骨細(xì)胞內(nèi)的受體結(jié)合,抑制破骨細(xì)胞的活性;當(dāng)與成骨細(xì)胞的受體結(jié)合時(shí),可刺激成骨細(xì)胞分泌膠原酶,釋放生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子,增強(qiáng)成骨細(xì)胞的活性,促進(jìn)骨質(zhì)生長(zhǎng),加速骨形成,可有效地預(yù)防骨質(zhì)疏松的形成。
　　 植物雌激素可以分為異黃酮類(Isoflavones),香豆素類(Coumarin)木脂素類(Lignans),黃酮醇類(Flavonol)等幾類。根據(jù)以往的實(shí)驗(yàn)研究和文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)不同種類的植物雌激素對(duì)成骨細(xì)胞均

5、有促增殖與分化的作用,但是綜合比較各類植物雌激素對(duì)成骨細(xì)胞作用方面的研究目前還沒(méi)有人報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的方法,觀察不同種類的植物雌激素對(duì)成骨細(xì)胞增殖與分化的影響;采用RT-PCR的技術(shù),檢測(cè)各類植物雌激素對(duì)成骨細(xì)胞分泌的Ⅰ型膠原COLⅠ mRNA,細(xì)胞內(nèi)TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子smad4 mRNA和核結(jié)合因子runx2 mRNA表達(dá)的影響,在細(xì)胞水平比較各類植物雌激素對(duì)成骨細(xì)胞作用的強(qiáng)弱,以及其在分子水平作用機(jī)制的異同,以期

6、為抗骨質(zhì)疏松新藥的篩選、研發(fā)以及聯(lián)合用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1采用改良的組織塊法分離培養(yǎng)新生(24 h內(nèi))SD大鼠顱骨成骨細(xì)胞。將不同濃度的四類植物雌激素(10-9 mol/L和10-7mol/L)加入到培養(yǎng)成骨細(xì)胞的培養(yǎng)基中,用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的改變。
　　 2采用噻唑藍(lán)比色(MTT)法,以雌二醇(estrogen,E2)為陽(yáng)性對(duì)照組,檢測(cè)加藥后,不同濃度的四類植物雌激素12 h,2

7、4 h,36 h對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響。
　　 3采用對(duì)硝基苯二鈉基質(zhì)動(dòng)力學(xué)法(pNPP)法,以雌二醇為陽(yáng)性對(duì)照組,檢測(cè)不同濃度的四類植物雌激素在24 h,48 h,72 h對(duì)大鼠成骨細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性的影響。
　　 4采用放射免疫法(RIA)法,以雌二醇為陽(yáng)性對(duì)照組,檢測(cè)不同濃度的四類植物雌激素在24 h,48 h和72 h對(duì)大鼠成骨細(xì)胞骨鈣素(BGP)水平的影響。
　　 5采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(

8、reverse transcriptase PCR,RT-PCR)方法,檢測(cè)大鼠成骨細(xì)胞在含10-7mol/L濃度的各類植物雌激素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h后對(duì)Ⅰ型膠原(COLⅠ)mRNA,smad4 mRNA,runx2 mRNA的表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1陽(yáng)性對(duì)照組雌二醇對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖與分化的影響
　　 1.1陽(yáng)性對(duì)照組雌二醇細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
　　 剛接種的成骨細(xì)胞成球形,懸浮于培養(yǎng)液中,逐漸沉

9、降貼壁,24 h細(xì)胞貼壁展開(kāi)。展開(kāi)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,呈多角形,培養(yǎng)72 h～96 h,細(xì)胞為長(zhǎng)梭形、條索狀,融合成片,分界較為模糊。培養(yǎng)96 h～120 h,細(xì)胞呈鋪路石狀態(tài)。如果再繼續(xù)培養(yǎng),細(xì)胞逐漸聚集形成細(xì)胞小結(jié),隨后膠原堆積,鈣鹽沉積,形成不透光的礦化結(jié)節(jié)。連續(xù)培養(yǎng)20代,可見(jiàn)細(xì)胞體積增大,胞質(zhì)稀薄,細(xì)胞分裂速度下降等一系列細(xì)胞衰老的表現(xiàn)。雌激素組與空白對(duì)照組相比,在72 h～96 h時(shí),細(xì)胞更加密集,細(xì)胞間隙少,形態(tài)無(wú)明顯差異。<

10、br>　　 1.2陽(yáng)性對(duì)照組雌二醇對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響
　　 大鼠成骨細(xì)胞在含有不同濃度雌二醇的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。濃度為1×10-7 mol/L時(shí),培養(yǎng)24 h時(shí)有促增殖作用(P＜0.01);濃度為1×10-9 mol/L時(shí),12 h、24 h有促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞增殖作用,其中12 h較為明顯(P＜0.01)。
　　 1.3陽(yáng)性對(duì)照組雌二醇對(duì)大鼠成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響
　　 大鼠成骨細(xì)胞在含有不同濃度

11、雌二醇的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h,48 h,72 h,雌二醇組1×10-7 mol/L,1×10-9mol/L兩個(gè)濃度組沒(méi)有提高大鼠成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性的作用(P＞0.05)。
　　 1.4雌二醇組對(duì)大鼠成骨細(xì)胞分泌骨鈣素(BGP)水平的影響
　　 大鼠成骨細(xì)胞在含有不同濃度雌二醇的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng),在1×10-7mol/L濃度時(shí):48 h、72 h時(shí),成骨細(xì)胞分泌骨鈣素水平與空白組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.

12、05);濃度為1×10-9mol/L時(shí):24 h、72 h時(shí),成骨細(xì)胞分泌骨鈣素水平與空白組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2四類植物雌激素組對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖與分化的影響
　　 2.1四類植物雌激素組細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察與雌二醇組類似。
　　 2.2四類植物雌激素對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響
　　 大鼠成骨細(xì)胞分別在含補(bǔ)骨脂素(10-7或10-9 mol/L),五味子甲素(10-7或10-9 mol/L

13、),山奈酚(10-7或10-9 mol/L),大豆苷元(10-7或10-9mol/L)的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)后與空白組比較。當(dāng)植物雌激素的濃度為10-7 mol/L時(shí):12 h,大豆苷元和補(bǔ)骨脂素與空白組相比有促增殖作用;24 h,大豆苷元,補(bǔ)骨脂素,山奈酚與空白組相比有促增殖作用;36 h,五味子甲素與空白組相比有促增殖的作用。當(dāng)植物雌激素的濃度10-9 mol/L時(shí):12 h,五味子甲素,補(bǔ)骨脂素與空白組相比有促增殖作用;24

14、h,補(bǔ)骨脂素與空白組相比有促增殖的作用;36 h,大豆苷元,五味子甲素,補(bǔ)骨脂素,山奈酚與空白組相比有促增殖作用。
　　 2.3四類植物雌激素對(duì)大鼠成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響
　　 大鼠成骨細(xì)胞分別在含補(bǔ)骨脂素(10-7或10-9 mol/L),五味子甲素(10-7或10-9 mol/L),山奈酚(10-7或10-9 mol/L),大豆苷元(10-7或10-9 mol/L)的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)后與空白組比較。當(dāng)植

15、物雌激素的濃度為10-7 mol/L時(shí):24 h,五味子甲素與空白組相比較能提高堿性磷酸酶的活性;48 h,五味子甲素能提高堿性磷酸酶的活性;72 h,山奈酚和大豆苷元能提高堿性磷酸酶的活性。當(dāng)植物雌激素的濃度為10-9 mol/L時(shí):24 h,山奈酚,大豆苷元和五味子甲素能提高堿性磷酸酶的活性;48 h,大豆苷元,五味子甲素,補(bǔ)骨脂素,山奈酚能提高堿性磷酸酶的活性;72 h,山奈酚,五味子甲素能提高堿性磷酸酶的活性。
　　 結(jié)

16、論:
　　 1從細(xì)胞水平上來(lái)看四類植物雌激素均對(duì)大鼠成骨細(xì)胞有促增殖與分化的作用,但是對(duì)大鼠成骨細(xì)胞影響的階段和起效的時(shí)間不相同。
　　 2在增殖實(shí)驗(yàn)中,五味子甲素和補(bǔ)骨脂素的效果優(yōu)于大豆苷元和山奈酚;在分化實(shí)驗(yàn)中,五味子甲素和山奈酚對(duì)分化早期指標(biāo)堿性磷酸酶的效果較其它植物雌激素好;五味子甲素和補(bǔ)骨脂素對(duì)于分化晚期指標(biāo)骨鈣素的效果較其它種類植物雌激素好。
　　 3在細(xì)胞水平比較,總體來(lái)看補(bǔ)骨脂素和五味子甲素優(yōu)于大

17、豆苷元(大豆異黃酮之一),甚至接近或超過(guò)雌激素。這對(duì)防治骨質(zhì)疏松化合物的篩選及研發(fā)有重要意義。
　　 4在分子水平研究發(fā)現(xiàn)各類植物雌激素影響的細(xì)胞因子不相同,反映了植物雌激素作用于成骨細(xì)胞的多途徑性。
　　 5在分子水平的研究發(fā)現(xiàn):大豆苷元對(duì)成骨細(xì)胞的作用影響的是Ⅰ型膠原COLⅠ mRNA的分泌,在這方面它優(yōu)于其它類植物雌激素;補(bǔ)骨脂素主要影響的是smad4途徑;山奈酚,五味子甲素,大豆苷元都對(duì)Runx2/Cbfa1 m