香豆素類化合物對大鼠成骨細胞的細胞生物活性影響的實驗研究.pdf

1、目的：骨質(zhì)疏松(osteoporosisOP)是以骨量減少，骨微觀結構退化為特征致使骨脆性增加以及易于發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病。骨質(zhì)疏松一般分為兩大類：即原發(fā)性骨質(zhì)疏松和繼發(fā)性骨質(zhì)疏松。前者又分為：絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(postmenopausalosteoporosis，PMOP)和老年性骨質(zhì)疏松(senileosteoporosis，SOP)。PMOP是原發(fā)性骨質(zhì)疏松中的最常見類型。由于骨質(zhì)疏松癥引起的骨折等并發(fā)癥，對人們健康和生活造

2、成的嚴重威脅，重視骨質(zhì)疏松癥及其骨折的防治成為我們所面臨的一項艱巨任務。 OP的發(fā)生是由骨代謝異常引起的，骨組織的代謝是一個舊骨不斷被吸收，新骨不斷形成的周而復始的過程。正常成熟骨的骨代謝主要以骨重建形式進行。骨重建的具體過程包括以破骨細胞激活、骨吸收開始和與之相偶聯(lián)的成骨細胞激活、骨形成而終結。成骨細胞是骨形成的主要功能細胞，負責骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化，能表達多種骨相關基因，分泌多種蛋白質(zhì)和多肽，其數(shù)量和活性直接影響著骨代謝

3、的平衡。 成骨細胞產(chǎn)生的堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)在堿性條件下水解多種磷酸酯，并具有轉(zhuǎn)磷酸基作用，有利于骨的礦化，是成骨細胞分化早期的特異性指標，其活性反映了成骨細胞的成骨活性。 成骨細胞分泌的骨鈣素(boneGlaprotein，BGP)是一種非膠原蛋白，其主要功能是與羥磷灰石結合，促進骨的礦化。是骨形成功能的良好標志物，被認為是成骨細胞分化晚期即礦化期的標志。 成骨細胞表達雌

4、激素受體(estrogenreceptor，ER)。ER屬核受體超家族成員，是一類由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，介導大部分的雌激素反應。ER包括ERα和ERβ兩種亞型。研究證實大鼠成骨細胞同時表達ERα和ERβ。 雌激素可通過ER調(diào)節(jié)成骨細胞的生成和活性，對治療PMOP療效肯定，但其長期應用的安全性令人擔憂。植物雌激素(phytoestrogen，PE)作為具有雌激素樣作用的一類物質(zhì)，可有效預防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，同時不伴有雌激素替代療法(

5、estrogenreplacementtherapy，ERT)的并發(fā)癥，是目前治療骨質(zhì)疏松藥物的研究熱點之一。 中醫(yī)理論認為，腎主骨、生髓，骨質(zhì)疏松癥屬于“骨痿”、“骨痹”的范圍，其發(fā)病的始動因素是腎精虧損。所以研究抗骨質(zhì)疏松藥物多從補腎藥物著手，而許多補腎中藥中含有植物雌激素。植物雌激素包括異黃酮類、木脂素類及香豆素類三類化合物，補腎中藥蛇床子和補骨脂中分別含有香豆素類化合物蛇床子素和補骨脂素，其是否對骨質(zhì)疏松有一定的防治作用

6、，是否可作為雌激素的替代藥物? 本實驗采用成骨細胞體外培養(yǎng)、分子生物學的技術和方法，研究蛇床子素和補骨脂素對成骨細胞增殖、分化及ER表達的影響，旨在尋求雌激素替代藥物，并探討其治療骨質(zhì)疏松的機制。 方法：1成骨細胞的培養(yǎng)用改良的組織塊法分離培養(yǎng)新生(24h內(nèi))SD大鼠顱骨成骨細胞。將不同濃度的蛇床子素和補骨脂素加入到成骨細胞的培養(yǎng)基中。 2細胞形態(tài)學觀察每日通過倒置顯微鏡觀察對照組和藥物處理組細胞的形態(tài)、生長狀況

7、之間的差別。 3利用噻唑蘭(MTT)法檢測對照組和各藥物處理組的細胞增殖。 4ALP比活性的測定用對硝基苯二鈉基質(zhì)動力學法檢測ALP活性的改變。比活性用U/L表示。 5骨鈣素的測定骨鈣素的測定采用放射性免疫法(RIA)，用γ計數(shù)器測定每分鐘放射性計數(shù)(CPM)。 6成骨細胞總RNA采用異硫氰酸胍一步法提取。 7mRNA表達的定量用β-actin作為內(nèi)參照，RT-PCR測定各組成骨細胞ERβ的相對表

8、達量。 結果：1細胞形態(tài)學觀察藥物處理組與對照組相比，細胞數(shù)量較密集，細胞間隙少，形態(tài)無明顯差異。 2蛇床子素及補骨脂素對成骨細胞增殖的影響 2.1蛇床子素對成骨細胞增殖的影響在不同濃度(1×10-8mol/L～1×10-4mol/L)的蛇床子素中培養(yǎng)24h和48h，1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L組與對照組相比有明顯的促增殖作用，有統(tǒng)計學意義，1×10-6mol/L組(P＜

9、0.05)，1×10-7mol/L、1×10-8mol/L組(P＜0.01)。培養(yǎng)72h后，僅1×10-7mol/L、1×10-8mol/L組表現(xiàn)促增殖作用(P＜0.01)。 2.2補骨脂素對成骨細胞增殖的影響在不同濃度(20μmol/L～1μmol/L)的補骨脂素中培養(yǎng)24h無明顯促增殖作用；培養(yǎng)48h，20μmol/L、15μmol/L、10μmol/L、5μmol/L濃度組產(chǎn)生顯著的促增殖作用，有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)

10、；培養(yǎng)72h，1μmol/L、10μmol/L、20μmol/L有顯著的促增殖作用(P＜0.05)；培養(yǎng)96h，10μmol/L、20μmol/L，5μmol/L組表現(xiàn)出促增殖作用(P＜0.05)，1μmol/L組不表現(xiàn)促增殖作用；培養(yǎng)120h，10μmol/L、20μmol/L、5μmol/L及1μmol/L組均表現(xiàn)促增殖作用(P＜0.01)。 3蛇床子素及補骨脂素對成骨細胞ALP的影響3.1蛇床子素對成骨細胞ALP的影響培養(yǎng)

11、24h及48h后，均表現(xiàn)為1×10-5mol/L組與對照組相比有明顯的促進分化作用，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；培養(yǎng)72小時后試驗組與對照組相比均無統(tǒng)計學意義。 3.2補骨脂素對成骨細胞ALP的影響培養(yǎng)48h、72h后，10μmol/L、15μmol/L組與對照組相比較，有明顯的促進分化作用(P＜0.01)，培養(yǎng)72h1μmol/L時對ALP的表達呈現(xiàn)抑制作用(P＜0.05)。 4蛇床子素對成骨細胞BGP的影響培養(yǎng)48

12、h、72h后均表現(xiàn)為，1×10-7mol/L、1×10-8mol/L組與對照組相比有促骨鈣素表達的作用(P＜0.01)，有統(tǒng)計學意義。 5補骨脂素對成骨細胞ERβmRNA表達的影響培養(yǎng)48h后，10μmol/L組、15μmol/L組及20μmol/L組ERmRNA的相對表達量分別為0.978±0.042、0.982±0.036和1.038±0.078，與對照組0.922±0.103相比均無顯著性差異，培養(yǎng)72h后，10μmol/

13、L組15μmol/L組ERmRNA的相對表達量分別為1.572±0.339、1.517±0.298，與對照組0.939±0.097相比有顯著性差異(P＜0.01)。20μmol/L組ERmRNA的相對表達量為0.918±0.116與對照組相比無顯著性差異。 結論：1蛇床子素及補骨脂素可促進成骨細胞的增殖。 2蛇床子素及補骨脂素能提高成骨細胞堿性磷酸酶的活性，促進成骨細胞分化。 3蛇床子素能提高成骨細胞骨鈣素的活性