人牙周膜干細(xì)胞雌激素受體的表達(dá)及雌激素對(duì)細(xì)胞骨分化能力影響的研究.pdf

1、絕經(jīng)后婦女由于雌激素水平下降，易于引發(fā)骨質(zhì)疏松，對(duì)骨質(zhì)疏松與頜骨、牙槽骨關(guān)系的研究表明,骨質(zhì)疏松癥的絕經(jīng)后婦女下頜骨量與全身骨量有明顯的相關(guān)關(guān)系，絕經(jīng)后可出現(xiàn)不同程度的牙槽骨骨質(zhì)疏松癥狀[1-4]。雌激素替代療法（estrogenreplacementtreatment，ERT）可有效提高絕經(jīng)期婦女體內(nèi)雌激素的水平，是預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥及骨折的有效方法[2]，同時(shí)，ERT也可減少牙周炎患者的牙齦出血和附著喪失，維持牙槽骨的骨量，提高牙

2、齒的保留率[5，6]。牙周膜細(xì)胞是牙周膜內(nèi)的主要成分，對(duì)維持牙周膜的形態(tài)、功能有決定性的作用，并且在牙槽骨的改建中發(fā)揮重要作用。以往的研究顯示牙周膜細(xì)胞內(nèi)有雌激素受體的表達(dá)，而且在外源性雌激素作用下，牙周膜細(xì)胞的成骨作用增強(qiáng)[7]。在牙周膜內(nèi)有數(shù)種細(xì)胞成分，除占主要地位的牙周膜成纖維細(xì)胞外，還有成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞及未分化間充質(zhì)細(xì)胞--牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs），PDLSCs是牙周膜內(nèi)各主要功能細(xì)胞的來(lái)源[8]，而PDLSCs與雌激素在

3、牙周改建及再生過(guò)程中的關(guān)系尚無(wú)研究報(bào)道。由此，我們?cè)O(shè)想，牙周膜干細(xì)胞內(nèi)是否也有雌激素受體的表達(dá)，如果有雌激素受體表達(dá)，外源性雌激素對(duì)牙周膜干細(xì)胞成骨作用有何影響？通過(guò)本研究，我們將對(duì)這些問(wèn)題進(jìn)行探討，以進(jìn)一步明確雌激素在牙周改建及再生中的作用機(jī)制，為牙周病及正畸臨床治療提供一定新的思路和理論基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：
　?。?）收集臨床拔除的正常人牙周健康、無(wú)齲的新鮮第三磨牙,刮取根中1/3牙周膜組織進(jìn)行牙周膜原代細(xì)胞培養(yǎng)。取第

4、四代人牙周膜細(xì)胞，通過(guò)免疫磁珠技術(shù)，以復(fù)合間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記物STRO-1抗體的磁珠對(duì)人牙周膜干細(xì)胞進(jìn)行篩選、擴(kuò)增培養(yǎng)，MTT法測(cè)定PDLSCs生長(zhǎng)曲線(xiàn)并與牙周膜細(xì)胞進(jìn)行比較。
　?。?）取第三代PDLSCs進(jìn)行克隆形成率、細(xì)胞周期分析，對(duì)其生物學(xué)行為進(jìn)行研究；以流式細(xì)胞儀對(duì)PDLSCs及牙周膜細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表面特異性抗原CD34、CD44、CD45、CD146表達(dá)測(cè)定；以免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)PDLSCs進(jìn)行干細(xì)胞表面特異性抗原S

5、TRO-1及間充質(zhì)細(xì)胞相對(duì)特異性抗原Vimentin表達(dá)測(cè)定；PDLSCs成脂及成骨多向誘導(dǎo)分化研究。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)對(duì)所分離的PDLSCs干細(xì)胞特征進(jìn)行鑒定。
　?。?）取第三代PDLSCs以免疫細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行ERα及ERβ特異性抗體染色；以逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)PDLSCs在雌激素作用前后ERα及ERβmRNA表達(dá)的變化并與牙周膜細(xì)胞作比較研究；以Westernblot法分析PDLSCs在雌激素作用前后ERα

6、及ERβ蛋白表達(dá)的變化并與牙周膜細(xì)胞作比較研究。
　　（4）取第三代PDLSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，加入不同濃度梯度（10-7、10-8、10-9M）的外源性雌激素（17β-雌二醇），MTT法測(cè)定成骨分化過(guò)程中的PDLSCs在雌激素作用下的細(xì)胞增殖變化情況。
　?。?）取第三代PDLSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，加入不同濃度梯度（10-7、10-8、10-9M）的外源性雌激素（17β-雌二醇），并以ER抑制劑ICI182780作對(duì)照，進(jìn)行堿

7、性磷酸酶（ALP）表達(dá)變化及羥脯氨酸含量的檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　?。?）所篩選PDLSCs呈類(lèi)梭形外觀，形態(tài)不規(guī)則，核為卵圓形、位于胞質(zhì)中央，似成纖維樣細(xì)胞。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)示可見(jiàn)PDLSCs較牙周膜細(xì)胞生長(zhǎng)慢，具有慢增殖周期的干細(xì)胞特點(diǎn)。
　?。?）PDLSCs生物學(xué)研究顯示其具備克隆形成能力及干細(xì)胞細(xì)胞周期特點(diǎn)，流式分析顯示所分離PDLSCs高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44及CD146，內(nèi)皮細(xì)胞及造血系細(xì)胞表面標(biāo)記

8、物CD34和CD45表達(dá)極低；干細(xì)胞表面特異性抗原STRO-1及間充質(zhì)細(xì)胞相對(duì)特異性抗原Vimentin染色均為陽(yáng)性，此外，PDLSCs經(jīng)成脂及成骨誘導(dǎo)獲得了茜素紅染色陽(yáng)性的類(lèi)成骨細(xì)胞和油紅-O染色陽(yáng)性的類(lèi)脂肪細(xì)胞。
　?。?）免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示ERα及ERβ在PDLSCs中均陽(yáng)性表達(dá)，定位于細(xì)胞核；RT-PCR及Westernblot檢測(cè)示：在mRNA及蛋白水平，均可檢測(cè)到ERα及ERβ表達(dá)，且ERα表達(dá)高于ERβ。此外，PD

9、LSCs與同來(lái)源牙周膜細(xì)胞相比，ERα及ERβ的表達(dá)較高；而PDLSCs在雌激素作用后ERα及ERβ的表達(dá)較作用前均增加。
　?。?）在17-β雌二醇作用下，PDLSCs的增殖發(fā)生變化，與對(duì)照組相比，前3天雌激素干擾組細(xì)胞增殖受到抑制，此后雌激素干擾組細(xì)胞增殖高于對(duì)照組，在不同藥物濃度組間，1×10-7M組對(duì)細(xì)胞增殖影響最為明顯，其細(xì)胞增殖水平高于其余兩組。
　　（5）在17-β雌二醇作用下，PDLSCs堿性磷酸酶（ALP）

10、的表達(dá)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，自第三天開(kāi)始，各組ALP表達(dá)均升高，而雌激素干擾組ALP表達(dá)量高于對(duì)照組，在不同藥物濃度組間1×10-7M組ALP表達(dá)增加高于其余兩組。
　?。?）在17-β雌二醇作用下，PDLSCsⅠ型膠原合成表達(dá)與對(duì)照組相比有增加趨勢(shì)，且與藥物濃度有劑量依賴(lài)關(guān)系，在不同藥物濃度組間1×10-7M組作用最為明顯。
　　結(jié)論：
　　（1）用復(fù)合間充質(zhì)干細(xì)胞特異性抗體STRO-1的免疫磁珠可自牙周膜細(xì)胞中成功篩選PD

11、LSCs，所篩選PDLSCs具有克隆形成、慢細(xì)胞周期、表達(dá)干細(xì)胞特異性標(biāo)記物及多向分化能力等干細(xì)胞特點(diǎn)。
　　（2）PDLSCs中ERα及ERβ均有表達(dá)，ERα表達(dá)高于ERβ，提示雌激素對(duì)PDLSCs的調(diào)控作用可能主要通過(guò)ERα途徑；在外源性雌激素作用下，成骨分化過(guò)程中ERα及ERβ表達(dá)均增加，提示PDLSCs可能是雌激素調(diào)控牙周改建的上游細(xì)胞，雌激素通過(guò)其受體對(duì)PDLSCs的成骨分化進(jìn)行調(diào)控。
　?。?）雌激素可促進(jìn)PDL