雌激素受體β在人牙周膜成纖維細(xì)胞成骨分化中作用的研究.pdf

1、骨密度降低與骨質(zhì)疏松是骨代謝增齡改變的結(jié)果，是中老年骨骼生理的主要特征。絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松發(fā)展迅速，與機(jī)體雌激素缺乏有關(guān)。研究表明雌激素在骨吸收與改建中發(fā)揮了極其重要的作用。牙槽骨是機(jī)體骨質(zhì)密度較低的骨組織，最容易發(fā)生骨質(zhì)疏松，主要表現(xiàn)為牙槽骨吸收，導(dǎo)致牙齒松動與脫落，直接影響患者牙齒和牙周組織健康與口腔治療，但至今對牙槽骨吸收與改建的機(jī)理并不十分明確。
　　人牙周膜成纖維細(xì)胞（Humanperiodontalligamentfi

2、broblast，HPLF）是牙周組織中重要的細(xì)胞成分，通過增殖、分化、分泌基質(zhì)參與到牙周組織的改建中，研究表明雌激素能夠促進(jìn)牙周膜成纖維細(xì)胞向成骨分化，增加其成骨活力，對于維持牙周組織正常的改建和損傷后的修復(fù)有重要的意義。雌激素的生物學(xué)作用主要是通過細(xì)胞內(nèi)雌激素受體（Estrogenreceptor，ER）介導(dǎo)的，研究證實(shí)牙周膜成纖維細(xì)胞有ER基因的表達(dá)，但雌激素受體在牙周膜成纖維細(xì)胞成骨分化中所起的作用及其機(jī)理尚不清楚。因此，為了探

3、討雌激素受體在牙周膜成纖維細(xì)胞成骨分化中的作用，以期進(jìn)一步探明雌激素受體在牙槽骨吸收與改建中的作用以及骨質(zhì)疏松牙槽骨吸收的機(jī)理，進(jìn)而為減緩牙槽骨吸收、維護(hù)牙齒穩(wěn)固性開辟新的途徑，我們設(shè)計(jì)并進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)：
　　1、雌激素受體在人牙周膜成纖維細(xì)胞中的表達(dá)
　　取因正畸原因拔除的第一前磨牙牙周膜組織，用組織塊結(jié)合酶消化法培養(yǎng)人牙周膜成纖維細(xì)胞，采用RT-PCR法檢測ERα和ERβmRNA的表達(dá)，Westernblot法分析ERα

4、和ERβ蛋白的表達(dá)。
　　2、ERβ基因siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及其在人牙周膜成纖維細(xì)胞中的表達(dá)
　　依據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，結(jié)合ERβ基因的序列特征，設(shè)計(jì)合成靶向ERβ的siRNA，將其插入pSilencer3.1-H1-neo載體，構(gòu)建ERβ基因的siRNA真核表達(dá)載體，并對其進(jìn)行鑒定。應(yīng)用脂質(zhì)體法將干涉載體瞬時轉(zhuǎn)染HPLF細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR、Westernblot法初步鑒定瞬時轉(zhuǎn)染前后HPLF細(xì)胞中ERβ基因及蛋白

5、表達(dá)水平有無變化。經(jīng)G418抗性篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR、Westernblot法分別檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染siRNA真核表達(dá)載體前后HPLF細(xì)胞中ERβmRNA和蛋白水平的變化。
　　3、雌激素受體β對人牙周膜成纖維細(xì)胞成骨分化能力的影響
　　以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HPLF（HPLF-siERβ1和HPLF-siERβ2）和未轉(zhuǎn)染的HPLF為研究對象，在雌激素刺激下，檢測細(xì)胞堿性磷酸酶（Alkalinephosphatase

6、，ALP）活性和骨鈣素（Osteocalcin，OCN）含量，研究雌激素及雌激素受體對HPLF細(xì)胞成骨分化能力的影響。
　　4、雌激素受體β對人牙周膜成纖維細(xì)胞OPG和RANKL表達(dá)的影響
　　以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HPLF（HPLF-siERβ1和HPLF-siERβ2）和未轉(zhuǎn)染的HPLF為研究對象，雌激素干預(yù)后，RT-PCR、Westernblot分別檢測OPG、RANKLmRNA和蛋白的表達(dá)，研究雌激素對HPLF細(xì)胞OPG和RA

7、NKL表達(dá)的影響，以及ERβ基因干涉后，細(xì)胞OPG和RANKL表達(dá)的變化情況。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)：
　　1、ERα、ERβmRNA和蛋白在HPLF細(xì)胞中均有表達(dá)，而且ERβ的表達(dá)明顯高于ERα。
　　2、通過測序驗(yàn)證，成功構(gòu)建了ERβ基因siRNA真核表達(dá)載體。RT-PCR和Westernblot法檢測分別表明瞬時轉(zhuǎn)染的HPLF中ERβ基因的表達(dá)、蛋白含量均受到明顯抑制。經(jīng)過G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HPLF細(xì)胞，RT-P

8、CR、Westernblot檢測結(jié)果再次表明，siRNA明顯抑制了HPLF細(xì)胞中ERβ基因的表達(dá)。
　　3、雌激素對細(xì)胞干預(yù)后，未轉(zhuǎn)染的HPLF細(xì)胞ALP活性和OCN含量明顯增強(qiáng)，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HPLF細(xì)胞ALP活性和OCN含量沒有明顯改變。
　　4、雌激素干預(yù)細(xì)胞后，未轉(zhuǎn)染的HPLF細(xì)胞中OPGmRNA和蛋白的表達(dá)顯著增強(qiáng)，RANKLmRNA和蛋白的表達(dá)顯著減少，但穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HPLF細(xì)胞中OPG和RANKLmRNA和蛋白的表

9、達(dá)沒有明顯變化。
　　結(jié)論：
　　1、體外培養(yǎng)的人牙周膜成纖維細(xì)胞中可觀察到ER兩種亞型的表達(dá)。RT-PCR和Westernblot法分別從mRNA水平和蛋白水平證實(shí)了ERα、ERβ在HPLF上均有表達(dá)，且ERβ的表達(dá)明顯強(qiáng)于ERα，提示雌激素在HPLF細(xì)胞的增殖、分化中發(fā)揮作用是通過配體-受體途徑實(shí)現(xiàn)的，而且可能主要是以ERβ為主介導(dǎo)的。
　　2、ERβsiRNA表達(dá)載體能夠有效抑制HPLF細(xì)胞中ERβmRNA和蛋白

10、水平的表達(dá)。
　　3、雌激素明顯增加了未轉(zhuǎn)染的HPLF細(xì)胞ALP活性和OCN的含量，但對ERβ基因干涉的HPLF細(xì)胞ALP和OCN的表達(dá)沒有明顯影響。說明雌激素可能主要是通過ERβ亞基促進(jìn)牙周膜成纖維細(xì)胞向成骨方向分化，增強(qiáng)了牙周膜成纖維細(xì)胞的成骨活力。
　　4、HPLF細(xì)胞在雌激素作用下，其OPG的表達(dá)顯著提高，RANKL表達(dá)明顯減少，但HPLF細(xì)胞經(jīng)ERβsiRNA轉(zhuǎn)染封閉ERβ亞基后，雌激素對OPG和RANKL表達(dá)水平