尼古丁對牙周膜成纖維細(xì)胞(PDLFs)的細(xì)胞毒性和作用機制研究.pdf

1、研究背景：牙周病是牙列缺失、牙列缺損的主要病因之一，而吸煙是牙周病發(fā)生的重要致病因素。目前，吸煙人群牙周病發(fā)生的分子機制尚不清楚。本研究以煙草中最重要的致病因素之一—尼古丁為研究對象，采用細(xì)胞術(shù)的方法，對尼古丁的細(xì)胞毒性和作用機制進(jìn)行了研究，為牙周病的預(yù)防提供理論依據(jù)。
　　 目的：⑴確證尼古丁對人PDLFs的細(xì)胞毒性；⑵探討尼古丁對PDLFs的細(xì)胞毒性機制，以進(jìn)一步明確相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路所起的作用，為牙周病的預(yù)防和治療奠定分子研

2、究基礎(chǔ)。
　　 方法：培養(yǎng)人PDLFs細(xì)胞，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)和流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry，F(xiàn)CM)觀察不同濃度的尼古丁對PDLFs的細(xì)胞生長增殖抑制情況，對細(xì)胞周期的影響情況，以及分析細(xì)胞凋亡率的變化，從而分析尼古丁對PDLFs的毒性作用。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription polymerase chain react

3、ion，RT-PCR)檢測尼古丁干預(yù)PDLFs細(xì)胞24h后，相關(guān)凋亡蛋白PI3K、AKT、Bcl-2和Bax的mRNA水平；激光共聚焦顯微鏡測定細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強度；Western Blotting免疫印跡法檢測尼古丁作用PDLFs后，凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的蛋白表達(dá)水平。根據(jù)RT-PCR、Western Blotting和激光共聚焦顯微鏡測定的實驗結(jié)果，分析尼古丁對牙周的細(xì)胞毒性作用中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。
　　 結(jié)果：①

4、尼古丁對人PDLFs的細(xì)胞毒性不同濃度的尼古丁(10000μg/ml、1000μg/ml、100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/m1)作用于PDLFs細(xì)胞24 h、48 h和72h后，均能抑制PDLFs細(xì)胞的生長。隨著尼古丁濃度的增加，A490值逐漸減小；并且時間越長，A490值也逐漸減小。尼古丁作用PDLFs細(xì)胞48h后，G0G1期比例逐漸增高，而S期和G2期的比例則呈下降趨勢(P＜0.05)

5、。AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記結(jié)合流式細(xì)胞儀分析顯示：尼古丁實驗組分別作用于PDLFs細(xì)胞作用48h后，各實驗組細(xì)胞均出現(xiàn)凋亡，根據(jù)凋亡率排序為：1000μg/ml尼古丁實驗組＞10μg/ml尼古丁實驗組＞0.1μg/ml尼古丁實驗組。說明尼古丁對PDLFs細(xì)胞有增殖抑制作用、細(xì)胞周期阻遏作用和促凋亡作用。②尼古丁對PDLFs細(xì)胞線粒體信號通路的影響尼古丁作用于PDLFs細(xì)胞24h后，細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強度顯著增加，且隨著尼古

6、丁劑量的增加，細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強度值隨之增高(r=0.747、F=41.333、P=0.000)；Bcl-2的mRNA表達(dá)水平與正常對照組比較顯著下調(diào)，而Bax的表達(dá)水平上調(diào)，且隨著劑量的增加細(xì)胞內(nèi)Bcl-2轉(zhuǎn)錄隨之降低(r=0.851、F=80.014、P=0.000)，而Bax轉(zhuǎn)錄隨之增高(r=0.961、F=341.270、P=0.000)；Caspase3基因轉(zhuǎn)錄增加，且隨著尼古丁劑量的增加，Caspase3的基因轉(zhuǎn)錄呈逐漸增

7、高趨勢(r=0.935、F=318.371、P=0.000)。同時，Caspase3蛋白表達(dá)增加，且隨著尼古丁劑量的增加，Caspase3蛋白的翻譯水平表達(dá)呈逐漸增高趨勢(r=0.677、F=8.459、P=0.016)。說明尼古丁可引起PDLFs細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，胞內(nèi)[Ca2+]增加，Bcl-2基因表達(dá)顯著減低而Bax的表達(dá)水平上調(diào)，引起Cyt C釋放，PDLFs細(xì)胞凋亡發(fā)生。③PI3K/Akt信號通路在尼古丁致PDLFs凋亡中的保

8、護(hù)作用不同濃度的尼古丁作用于PDLFs細(xì)胞24h后，PI3K的表達(dá)水平上調(diào)，且隨著劑量的增加，PI3K的基因表達(dá)水平呈逐漸增高趨勢(r=0.675、F=8.379、P=0.016)；Akt的表達(dá)水平下調(diào)，且隨著尼古丁劑量的增加，Akt的基因表達(dá)水平呈逐漸降低趨勢(r=0.989、F=442.819、P=0.000)；Akt在各實驗組Thr308、Ser473位點磷酸化磷酸化顯著高于對照組(P＜0.01)；Caspase3基因轉(zhuǎn)錄增加，且

9、隨著尼古丁劑量的增加，Caspase3的基因轉(zhuǎn)錄呈逐漸增高趨勢(r=0.935、F=318.371、P=0.000)。同時，Caspase3蛋白表達(dá)增加，且隨著尼古丁劑量的增加，Caspase3蛋白的翻譯水平表達(dá)呈逐漸增高趨勢(r=0.677、F=8.459、P=0.016)。說明PI3K/Akt參與了尼古丁誘導(dǎo)的PDLFs細(xì)胞凋亡的過程，并且發(fā)揮了抑制凋亡發(fā)生的作用，但是尼古丁誘導(dǎo)的PDLFs細(xì)胞凋亡的促進(jìn)因素的作用效果強于PI3K/