CGRP上調(diào)TGF-β-BMP-2表達(dá)促牙周膜成纖維細(xì)胞纖維鈣化的作用機制研究.pdf

1、研究目的:
　　 牙周炎發(fā)生的初始原因是細(xì)菌、毒素因子和機體間的防御功能的平衡被打破所致。越來越多的研究表明與遺傳有關(guān)的宿主易感性是牙周炎發(fā)病過程中的主要決定因素之一。
　　 近年來，牙周病易感因素與基因多態(tài)性方面的研究漸漸受到重視。降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)陽性神經(jīng)纖維廣泛分布于牙周組織，特別是牙周炎的起始部位。有研究表明牙周組織受到外界刺激后，CGRP

2、等神經(jīng)肽可以通過特定的機制，調(diào)節(jié)口腔組織中的成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及血管的功能。另有研究表明CGRP是骨細(xì)胞的活性調(diào)節(jié)因子，可以促進(jìn)成骨分化及骨組織的形成。并且一定濃度的CGRP可促進(jìn)體外培養(yǎng)的牙周膜成纖維細(xì)胞的增殖，并對細(xì)胞表面黏附分子起促進(jìn)作用。
　　 研究證實，CGRP對人牙周膜成纖維細(xì)胞影響主要在于CGRP可促進(jìn)人牙周膜成纖維細(xì)胞的增殖、膠原合成、成骨分化等。但是對于CGRP在人牙周膜成纖維細(xì)胞的纖維鈣

3、化方面的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究國內(nèi)外鮮見報道。本研究試圖初步探討CGRP對人牙周膜細(xì)胞細(xì)胞增殖、膠原合成、纖維鈣化等作用可能涉及的信號通路。
　　 研究方法:
　　 第一部分:臨床采集健康牙齒，采用酶消化+組織貼附法，進(jìn)行人牙周膜成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)。運用sABC法，進(jìn)行波形絲蛋白和細(xì)胞角蛋白染色，對人牙周膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和免疫組織化學(xué)鑒定。以CGRP-A和CGRP-C基因為目的基因，以腺病毒為載體，采用腺病毒構(gòu)建技

4、術(shù)，構(gòu)建CGRP基因重組腺病毒(Ad.CGRP-A和Ad.CGRP-C)，感染人牙周膜成纖維細(xì)胞，并加以鑒定，作為細(xì)胞實驗的基礎(chǔ)。
　　 第二部分:通過Ad.CGRP-A和Ad.CGRP-C感染人牙周膜成纖維細(xì)胞后培養(yǎng)72h，運用細(xì)胞流式檢測、定量PCR測定和Western-blot測定的方法，檢測人牙周膜成纖維細(xì)胞增殖、凋亡水平變化、膠原合成分泌水平變化，以及MMP-2、MMP-9、OPN、CAP-3、ALP等效應(yīng)蛋白的表達(dá)水

5、平變化。探討CGRP-A、CGRP-C基因?qū)Ω腥镜娜搜乐苣こ衫w維細(xì)胞纖維鈣化作用的影響。
　　 第三部分:在單因素Ad.CGRP-A和Ad.CGRP-C感染人牙周膜成纖維細(xì)胞后培養(yǎng)72小時，運用定量PCR測定和Western-blot測定的方法，進(jìn)一步檢測BMP-2、BMP-4、BMP-7、TGF-β等細(xì)胞因子的變化。在分子水平上探討CGRP多態(tài)性基因作用于人牙周膜成纖維細(xì)胞后，對人牙周膜成纖維細(xì)胞的細(xì)胞增殖、膠原合成纖維化，成

6、骨鈣化等作用可能涉及的信號通路。
　　 結(jié)果:
　　 1、原代細(xì)胞培養(yǎng)成功，免疫熒光染色鑒定:波形絲蛋白染色呈陽性，角蛋白染色呈陰性，并選取四個細(xì)胞株作為后兩部分實驗的材料。
　　 2、成功構(gòu)建降鈣素基因相關(guān)肽的重組腺病毒Ad.CGRP-A和Ad.CGRP-C，并感染人牙周膜成纖維細(xì)胞表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽。
　　 3、細(xì)胞流式檢測顯示:Ad.CGRP-A處理組處于S/G2/M期的細(xì)胞比例顯著高于Ad.CG

7、RP-C處理組和空病毒對照組。Ad.CGRP-C處理組處于S/G2/M期的細(xì)胞比例顯著低于空病毒對照組。
　　 4、定量PCR檢測和Western-blot測定部分細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白(COL)、金屬蛋白酶(MMP)、成骨分化標(biāo)志物(ALP)及凋亡蛋白酶-3(CAP-3)基因結(jié)果顯示:(1) Ad.CGRP-A處理組COLI、Ⅲ、Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)水平顯著高于Ad.CGRP-C處理組和空病毒對照組;Ad.CGRP-C處理組COLI、

8、Ⅲ、Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)水平顯著低于空病毒對照組。
　　 (2) Ad.CGRP-A、Ad.CGRP-C處理組MMP-2的相對表達(dá)水平顯著高于空病毒對照組;且Ad.CGRP-C處理組的相對表達(dá)水平顯著高于Ad.CGRP-A處理組;MMP-9表達(dá)含量較低，沒有檢測到結(jié)果。
　　 (3) Ad.CGRP-A處理組蛋白ALP的相對表達(dá)水平明顯高于空病毒對照組;而Ad.CGRP-C處理組與空病毒對照組無明顯差異。
　　 (4

9、) Ad.CGRP-A處理組蛋白OPN的相對表達(dá)水平明顯高于空病毒對照組;而Ad.CGRP-C處理組相對表達(dá)水平顯著低于Ad.CGRP-A處理組與空病毒對照組。
　　 (5) Ad.CGRP-A處理組和Ad.CGRP-C處理組的CAP-3相對表達(dá)水平與空病毒對照組CAP-3的相對表達(dá)水平無明顯差異。
　　 5、定量PCR檢測和Western-blot測定，TGF及BMP家族基因表達(dá)結(jié)果顯示:
　　 (1)在觀察促

10、成骨鈣化的研究試驗中，通過對BMP-2、MBP-4、BMP-7幾個細(xì)胞因子的定量PCR實驗結(jié)果顯示: Ad.CGRP-A處理組BMP-2表達(dá)顯著高于空病毒對照組和Ad.CGRP-C處理組;但是Ad.CGRP-C處理組BMP-2表達(dá)水平與空病毒對照組無顯著差異;BMP-4組中，Ad.CGRP-A、Ad.CGRP-C處理組與空病毒對照組之間的相對表達(dá)水平無顯著差異;BMP-7表達(dá)含量較低，沒有檢測到結(jié)果。
　　 (2)在觀察促纖維化

11、的研究試驗中，Ad.CGRP-A、Ad.CGRP-C處理組TGF-β的相對表達(dá)水平均高于空病毒對照組;而Ad.CGRP-A處理組相對表達(dá)水平低于Ad.CGRP-C處理組。
　　 結(jié)論:
　　 1、CGRP-A顯著促人牙周膜成纖維細(xì)胞高表達(dá)BMP-2、OPN及ALP，提示CGRP通過激活BMP-2途徑促人牙周膜成纖維細(xì)胞成骨分化。CGRP-C可顯著抑制人牙周膜成纖維細(xì)胞中OPN表達(dá)，對BMP-2和ALP表達(dá)無顯著影響，提示

12、CGRP基因+5247位點的單核甘酸多態(tài)性顯著影響CGRP促人牙周膜成纖維細(xì)胞成骨分化。
　　 2、CGRP-A顯著促人牙周膜成纖維細(xì)胞高表達(dá)TGF-β、COLI型、COLⅢ型、COLⅣ型，此外CGRP-A顯著提高人牙周膜成纖維細(xì)胞中S/G2/M期細(xì)胞比例，提示CGRP通過激活TGF-β途徑促人牙周膜成纖維細(xì)胞增殖及纖維化。值得注意的是，盡管CGRP-C也可顯著促人牙周膜成纖維細(xì)胞高表達(dá)TGF-β，但同時CGRP-C顯著上調(diào)人牙