特異性Stealth siRNA抑制小鼠肺成纖維細(xì)胞TGF-β-,1-表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、纖維化可導(dǎo)致器官結(jié)構(gòu)破壞和功能減退、乃至衰竭，研究證實(shí)肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展與TGF-β1的高表達(dá)密切相關(guān)。TGF-βl由淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生，有多種生物活性；能刺激未成熟肺成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖，刺激細(xì)胞分化或基質(zhì)合成，增加ECM的聚積并抑制其降解；在肺纖維化形成過(guò)程中主要作用于膠原的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，誘導(dǎo)前膠原mRNA的產(chǎn)生，促進(jìn)膠原蛋白的形成和沉積。因此，TGF-β1是促進(jìn)肺纖維化的關(guān)鍵因子之一，抑制TGF-β1基因表達(dá)顯然有助于

2、延緩肺纖維化進(jìn)程，而應(yīng)用常規(guī)抗纖維化藥物抑制其表達(dá)的效果并不理想。RNAi技術(shù)具有高效、特異、安全地調(diào)節(jié)基因表達(dá)的特點(diǎn)，是人為導(dǎo)入正、反義RNA片段形成的雙鏈RNA，在體內(nèi)或體外培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生21et23核苷酸的siRNA，介導(dǎo)其互補(bǔ)同源mRNA序列特異性降解，從而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)。其作用類(lèi)似于基因敲除，但基因表達(dá)并未永遠(yuǎn)消除，因而又被稱為“基因沉默”。本研究針對(duì)BALB/c小鼠TGF-β1的mRNA序列設(shè)計(jì)并合成正義鏈經(jīng)化學(xué)修

3、飾的siRNA(即StealthsiRNA)，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的小鼠LFb，觀察并分析其對(duì)TGF-β1及其下游CTGF因子表達(dá)的影響，為肺纖維化的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1.小鼠肺成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)、鑒定及純化傳代 采用組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)小鼠肺成纖維細(xì)胞，HE染色光鏡觀察和波形蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定所得細(xì)胞，純化傳代至第3代細(xì)胞凍存?zhèn)溆谩?2.特異性StealthsiRNA的設(shè)計(jì)制備及轉(zhuǎn)染細(xì)

4、胞 根據(jù)BALB/c小鼠TGF-β1的mRNA序列應(yīng)用invitrogen公司的在線設(shè)計(jì)軟件BLOCK-iTTMRNAiDesigner，選擇三個(gè)位點(diǎn)分別靶向設(shè)計(jì)得到三套StealthsiRNA序列，并照序列制備StealthsiRNAs。將第4代細(xì)胞分至24孔板培養(yǎng)至匯合度達(dá)30～50％待用。 實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組、空轉(zhuǎn)染組、stealth_control組、stealth_48組、stealth_166組和stealth

5、_594組(4孔/組)，陰性對(duì)照組(stealth_control)主要用于檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。空白對(duì)照組不加刺激物，空轉(zhuǎn)染組只加入脂質(zhì)體而不加入StealthsiRNAs，其余各組通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染三套不同序列(stealtll_48、stealth_166、stealth_594.和stealth_control)的StealthsiRNA。 3.特異性StealthsiRNA對(duì)TGF-β1表達(dá)的干擾作用 分別選擇轉(zhuǎn)染0h、2

6、4h、48h、72h和96h共五個(gè)時(shí)相點(diǎn)，收集各組細(xì)胞分為三個(gè)部分，用免疫細(xì)胞化學(xué)法、RT-PCR和Westernblot法檢測(cè)細(xì)胞中TGF-β1及其下游的CTGF表達(dá)情況。觀察特異性StealthsiRNA對(duì)TGF-β1表達(dá)的干擾作用。 結(jié)果： 1.小鼠肺成纖維細(xì)胞HE染色和波形蛋白免疫組化鑒定及臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)細(xì)胞活力： 組織塊法分離培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)HE染色后，光學(xué)顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或多邊形，平行排列生長(zhǎng)，胞漿紅

7、染，胞核藍(lán)染，其內(nèi)可見(jiàn)2～3個(gè)藍(lán)色深染的核仁。細(xì)胞波形蛋白免疫組化染色陽(yáng)性，胞漿呈棕色。臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)培養(yǎng)的LFb細(xì)胞活力在96％左右。 2.特異性StealthsiRNA的設(shè)計(jì)合成及轉(zhuǎn)染效率 在GenBank網(wǎng)站上查得BALB/c小鼠FGF-β1mRNA序列，用在線軟件BLOCK-iTTMRNAiDesigner選擇三個(gè)位點(diǎn)，靶向設(shè)計(jì)得到三套StealthsiRNA序列，同時(shí)設(shè)計(jì)一套序列相同但不針對(duì)TGF-β1的ste

8、altn_control，并用FITC標(biāo)記，序列見(jiàn)表2-1，交由invitrogen公司合成。轉(zhuǎn)染后在不同的時(shí)相點(diǎn)觀察熒光表達(dá)情況，轉(zhuǎn)染效率均達(dá)98％以上。 3.小鼠肺成纖維細(xì)胞中TGF-β1及其下游的CTGF因子的表達(dá)情況 各組均可觀察到TGF-β1及其下游的CTGF因子陽(yáng)性表達(dá)，三組轉(zhuǎn)染StealthsiRNAs的細(xì)胞中陽(yáng)性表達(dá)明顯弱于對(duì)照組，其中stealth_166組陽(yáng)性表達(dá)最弱；而同組間在不同的時(shí)相點(diǎn)，其陽(yáng)性表

9、達(dá)也不同，轉(zhuǎn)染24h后并不能檢測(cè)到表達(dá)減低，48h后開(kāi)始檢測(cè)出表達(dá)減低，72h后表達(dá)減低最為明顯，但轉(zhuǎn)染96h后表達(dá)減低弱于前一時(shí)相點(diǎn)。 結(jié)論： 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在合成的特異性StealthsiRNAs作用下，體外培養(yǎng)的BALB/c小鼠肺成纖維細(xì)胞增殖速度減慢，細(xì)胞中TGF-β1及其下游的CTGF因子的表達(dá)也明顯低于對(duì)照組，說(shuō)明特異性StealthsiRNA可有效抑制目的基因TGF-β1的表達(dá)；同時(shí)這種抑制效應(yīng)存在一定的時(shí)-