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1、背景與目的: 瘢痕疙瘩是臨床上常見的病理性瘢痕,以成纖維細(xì)胞的異常增殖和細(xì)胞外基質(zhì)成分的過度堆積為主要特征。其生長行為有類似腫瘤的特性,表現(xiàn)為向周圍正常皮膚侵襲性生長、單純手術(shù)切除術(shù)后易復(fù)發(fā)等,發(fā)病機(jī)制至今不明,在治療上尚無特效方法,是目前整形外科研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問題之一。 在哺乳動(dòng)物中,鞘氨醇激酶(sphingosine kinase,SphK)有多種亞型,其中已有2種亞型被克隆出來,即SphK1和SphK2。SphK
2、1具有促進(jìn)細(xì)胞生長、抑制細(xì)胞凋亡的作用,SphK2主要作用是促進(jìn)細(xì)胞凋亡。轉(zhuǎn)化生長因子β(ransforming growth factorβ,TGF—β)是導(dǎo)致病理性瘢痕產(chǎn)生的重要因素之一,而且在人皮膚和肺的成纖維細(xì)胞中TGF—β1上調(diào)SphK1的表達(dá)。目前,國內(nèi)外有關(guān)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞SphK1和SphK2的表達(dá)及其與TGF—β1的關(guān)系未見報(bào)道。 本研究通過檢測(cè)SphK1和SphK2在人正常皮膚成纖維細(xì)胞和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞
3、中的表達(dá)差異,推斷兩者在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖過程中的作用;通過檢測(cè)加入TGF—β1前后SphK1和SphK2在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的表達(dá)差異,探討SphK1和SphK2與TGF—β的關(guān)系,以期能進(jìn)一步闡明瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制。 方法: 1、收集12例瘢痕疙瘩患者手術(shù)切除的瘢痕疙瘩及其周圍正常皮膚標(biāo)本,組織塊法培養(yǎng)成纖維細(xì)胞,取第3~8代成纖維細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),分為正常皮膚組、瘢痕疙瘩組和瘢痕疙瘩加轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF—β
4、1)組(瘢痕疙瘩+TGF—β1組)。 2、各組成纖維細(xì)胞分別培養(yǎng)爬片后,用免疫熒光法觀察各組細(xì)胞中SphK1和SphK2蛋白的分布; 3、Trizol法提取各組細(xì)胞的總RNA,反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,Real—Time PCR法定量檢測(cè)SphK1和SphK2 mRNA的表達(dá); 4、用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白,BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度,蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)SphK1和SphK2蛋白的表達(dá)。
5、 結(jié)果: 1、在各組成纖維細(xì)胞中,SphK1蛋白均主要分布于細(xì)胞核,而SphK2蛋白在細(xì)胞核和胞質(zhì)中均有表達(dá)。 2、正常皮膚組、瘢痕疙瘩組和瘢痕疙瘩+TGF—β1組SphK1mRNA表達(dá)分別是0.0383±0.0147、0.0608±0.0190和0.0790±0.0280,可見瘢痕疙瘩組SphK1mRNA表達(dá)明顯高于正常皮膚組,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);瘢痕疙瘩+TGF—β1組SphK1mRNA表達(dá)明
6、顯高于瘢痕疙瘩組,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。正常皮膚組、瘢痕疙瘩組和瘢痕疙瘩+TGF—β1組SphK2 mRNA表達(dá)分別是0.0036±0.0011、0.0032±0.0014和0.0033±0.0021,3組之間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組SphK1mRNA的表達(dá)較SphK2mRNA表達(dá)高,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);正常皮膚組、瘢痕疙瘩組和瘢痕疙瘩+TGF—β1組SphK1/SphK2mRNA比值分
7、別是10.5784±1.9007,20.2037±3.2254,22.7297±3.3306,可見瘢痕疙瘩組SphK1/SphK2比值明顯高于正常皮膚組,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);瘢痕疙瘩+TGF—β1組SphK1/SphK2mRNA比值明顯高于瘢痕疙瘩組,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 3、正常皮膚組、瘢痕疙瘩組和瘢痕疙瘩+TGF—β1組SphK1蛋白表達(dá)分別是0.6800±0.11260、0.8308±0.1
8、0930和1.4267±0.19380,可見瘢痕疙瘩組SphK1蛋白表達(dá)明顯高于正常皮膚組,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);瘢痕疙瘩+TGF—β1組SphK1蛋白表達(dá)明顯高于瘢痕疙瘩組,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。正常皮膚組、瘢痕疙瘩組和瘢痕疙瘩+TGF—β1組SphK2 mRNA表達(dá)分別是0.0763±0.0091、0.0724±0.0069和0.0773±0.0083,3組之間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組
9、SphK1蛋白表達(dá)較SphK2蛋白表達(dá)高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);正常皮膚組、瘢痕疙瘩組和瘢痕疙瘩+TGF—β1組SphK1/SphK2蛋白比值分別是8.8747±0.6927,11.4413±0.5012,18.4230±0.7713,可見瘢痕疙瘩組SphK1/SphK2蛋白比值明顯高于正常皮膚組,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);瘢痕疙瘩+TGF—β1組SphK1/SphK2比值明顯高于瘢痕疙瘩組,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P
10、<0.01)。 結(jié)論: 1、在正常皮膚和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中,SphK1和SphK2均有表達(dá),但二者的分布有差異,SphK1主要在細(xì)胞核中表達(dá),而SphK2在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中均有表達(dá)。 2、SphK1在正常皮膚和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中表達(dá)有差異,在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中SphK1mRNA水平和蛋白水平較正常皮膚成纖維細(xì)胞高,說明SphK1的高表達(dá)與瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系,SphK1可能是促進(jìn)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞
11、過度生長的一個(gè)重要因子;SphK2在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞中的mRNA和蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明SphK2雖有促凋亡的作用,但不能有效的促進(jìn)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的凋亡,不能有效地對(duì)抗SphK1導(dǎo)致促瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生長的作用。SphK1和SphK2作用的失衡,可能是導(dǎo)致瘢痕疙瘩增生的重要機(jī)制之一。 3、SphK1 mRNA和蛋白在正常皮膚和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的表達(dá)均比SphK2高,瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中Sp
12、hK1/SphK2mRNA和蛋白比值較正常皮膚成纖維細(xì)胞為高,存在SphK1的高表達(dá),反映了瘢痕疙瘩和正常皮膚中SphK1、SphK2的含量并不是相等的,在維持成纖維細(xì)胞的生長增殖過程中的作用是有差異的;SphK1/SphK2比值增高,可能與瘢痕疙瘩的過度生長有關(guān),可以預(yù)測(cè)SphK1/SphK2比值是判斷瘢痕疙瘩增生程度的指標(biāo)。 4、在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中加入TGF—β1刺激后,SphK1 mRNA水平和蛋白水平均表達(dá)增高,Sp
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