瘢痕疙瘩成纖維細胞DNMT1的表達及5-氮雜-2-脫氧胞苷對瘢痕疙瘩成纖維細胞的影響.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、第一部分:瘢痕疙瘩成纖維細胞DNMT1的表達及意義
  背景與目的:瘢痕疙瘩是整形燒傷外科常見的疾病之一,其發(fā)病機制與成纖維細胞的過度增生及膠原的大量無序沉積有關(guān),其確切機制尚不完全清楚。DNA的甲基化與眾多增生性疾病及纖維化性疾病的發(fā)病存在密切的聯(lián)系,而瘢痕疙瘩的發(fā)病是否與DNA甲基化有關(guān),瘢痕疙瘩甲基化相關(guān)因子的表達如何目前尚未見報道,因此,我們從表觀遺傳學(xué)的角度去探討瘢痕疙瘩發(fā)生的另一種可能的機制-DNA甲基化,并且可能為瘢

2、痕疙瘩的防治提供新的靶點與切入點。
  方法:收集53例瘢痕疙瘩患者手術(shù)切取的瘢痕疙瘩及其周圍正常皮膚標本,并按生長期分為A(<6個月)、B(6~12個月)、C(1~2年)、D(>2年)4組;使用免疫組織化學(xué)法檢測,比較各組標本正常皮膚、浸潤部、增生部及老化部成纖維細胞DNMT1的表達差異;RT-PCR法檢測各組標本及不同部位成纖維細胞DNMT1 mRNA的表達。
  結(jié)果:DNMT1在成纖維細胞中主要分布于胞核內(nèi);瘢痕疙瘩

3、成纖維細胞DNMT1蛋白陽性表達率及DNMT1 mRNA表達均高于正常皮膚成纖維細胞(P=0.001);瘢痕疙瘩生長期較短組成纖維細胞DNMT1陽性表達率及DNMT1 mRNA表達均高于生長期較長組(P=0.007);位于瘢痕疙瘩浸潤部的成纖維細胞DNMT1陽性表達率及DNMT1 mRNA表達均高于增生部與老化部(P=0.001)。
  結(jié)論:DNMT1在瘢痕疙瘩發(fā)病中具有重要作用;隨著瘢痕疙瘩生長期的延長,DNMT1的表達有降低

4、趨勢;隨著瘢痕疙瘩中部成纖維細胞老化,DNMT1表達降低。提示DNMT1在瘢痕疙瘩生長過程中起著重要的作用,并且與瘢痕疙瘩浸潤生長密切相關(guān)。
  第二部分瘢痕疙瘩成纖維細胞系的建立及生長特性研究
  目的:通過實驗條件的摸索構(gòu)建瘢痕疙瘩成纖維細胞的原代培養(yǎng)方法,觀察瘢痕疙瘩成纖維細胞的形態(tài)特征,初步研究瘢痕疙瘩成纖維細胞的生長特性,培養(yǎng)足夠的瘢痕疙瘩成纖維細胞為后階段實驗奠定堅實的基礎(chǔ)。
  方法:采用單細胞法原代培養(yǎng)

5、瘢痕疙瘩成纖維細胞并傳代培養(yǎng),摸索瘢痕疙瘩成纖維細胞生長的最佳環(huán)境及培養(yǎng)方法,在顯微鏡下觀察瘢痕疙瘩成纖維細胞的生長形態(tài),采用MTT法測定瘢痕疙瘩成纖維細胞生長曲線。
  結(jié)果:原代培養(yǎng)后,約第3天可見瘢痕疙瘩成纖維細胞貼壁生長,傳代時間在第15天左右;瘢痕疙瘩成纖維細胞形態(tài)如同梭形或星形,呈現(xiàn)漩渦狀或者放射狀的排列方式,MTT法測瘢痕疙瘩成纖維細胞生長曲線呈“S”型,瘢痕疙瘩成纖維細胞生長狀態(tài)良好,可作為下一步實驗的資源。

6、>  結(jié)論:瘢痕疙瘩成纖維細胞的原代及傳代培養(yǎng)過程順利,細胞生長狀態(tài)好,我們已成功構(gòu)建瘢痕疙瘩原代及傳代培養(yǎng)的整個體系,為我們下階段的實驗研究提供了保證。
  第三部分5-氮雜-2-脫氧胞苷對體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細胞生長周期及凋亡的影響
  背景與目的:近年來,對瘢痕疙瘩的發(fā)病機制及防治的研究越來越熱,然而對于瘢痕疙瘩的防治仍是整形燒傷外科的一大難題,第一部分我們已經(jīng)證實瘢痕疙瘩成纖維細胞存在DNMT1的高表達,因此,表

7、觀遺傳學(xué)中的DNA甲基化的研究在瘢痕疙瘩的防治中可能有積極意義。本實驗擬探討甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷對體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細胞生長周期及凋亡的影響,進一步探討瘢痕疙瘩與DNA甲基化的關(guān)系及尋找瘢痕疙瘩的治療方法。
  方法:原代培養(yǎng)人體瘢痕疙瘩及正常皮膚成纖維細胞。使用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷干預(yù)體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩及正常皮膚成纖維細胞,通過流式細胞技術(shù)檢測細胞在干預(yù)前后細胞生長周期及凋亡的變化情況。

8、
  結(jié)果:在同等條件下,瘢痕疙瘩成纖維細胞生長周期位于G0/G1期細胞數(shù)(P=0.035)及細胞凋亡數(shù)(P=0.006)較正常皮膚成纖維細胞低;5-氮雜-2-脫氧胞苷干預(yù)人瘢痕疙瘩成纖維細胞后,瘢痕疙瘩成纖維細胞停滯于G0/G1期比例增加(P=0.000),并且細胞凋亡率增加(P=0.047),而正常皮膚成纖維細胞組均無明顯變化(P均>0.05)。
  結(jié)論:甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷可將體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖

9、維細胞阻滯于G0/G1期,并且誘導(dǎo)細胞凋亡,進一步證明了瘢痕疙瘩的發(fā)生與基因的甲基化密切相關(guān),甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷可能成為瘢痕疙瘩防治的新選擇。
  第四部分5-氮雜-2-脫氧胞苷對體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細胞相關(guān)因子的影響
  背景與目的:前述研究發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩的發(fā)生與DNA甲基化存在密切聯(lián)系,并且甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷可抑制體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細胞的生長并誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細胞的凋亡。

10、因此,我們將進一步探討甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷對瘢痕疙瘩成纖維細胞相關(guān)因子DNMT1、TGF-β1mRNA、Smad7mRNA的作用。
  方法:常規(guī)原代及傳代培養(yǎng)人瘢痕疙瘩及正常皮膚成纖維細胞,使用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷干預(yù)體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩及正常皮膚成纖維細胞,細胞干預(yù)時間為72小時,通過RT-PCR技術(shù)檢測并比較瘢痕疙瘩及正常皮膚成纖維被藥物干預(yù)前后DNMT1、TGF-β1mRNA及Smad7m

11、RNA的表達水平差異。
  結(jié)果:體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細胞5-氮雜-2-脫氧胞苷干預(yù)組DNMT1、TGF-β1mRNA表達下降,Smad7mRNA表達回升,而正常皮膚成纖維細胞組無明顯變化。
  結(jié)論:瘢痕疙瘩成纖維細胞DNMT1及TGF-β1表達高于正常皮膚成纖維細胞,而Smad7表達低于正常皮膚成纖維細胞,在5-氮雜-2-脫氧胞苷的作用下,瘢痕疙瘩成纖維細胞相關(guān)因子表達趨于正常,5-氮雜-2-脫氧胞苷可能成為瘢痕疙瘩

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