ALA-PDT對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞周期影響及調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、目的：探討5-氨基酮戊酸（5-aminolevulnilic acid,ALA）光動(dòng)力療法（photodynamic therapy,PDT）對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（keloid fibroblasts,KFB）周期影響及調(diào)控機(jī)制的研究。
　　方法：
　　1.采用組織塊培養(yǎng)方法，分別體外培養(yǎng)KFB和正常皮膚成纖維細(xì)胞（human skin fibroblasts,HSFs），觀察其生物學(xué)特征；應(yīng)用抗波形蛋白抗體做免疫細(xì)胞化學(xué)鑒

2、定，證實(shí)為成纖維細(xì)胞（fibroblast,FB）。
　　2.KFB傳代培養(yǎng)后，選用第3-5代對數(shù)生長期的KFB進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別加入含有ALA0.25mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、2.0mmol/L、4.0mmol/L、8.0mmol/L的無血清高糖DMEM培養(yǎng)液，避光培養(yǎng)4h后，光動(dòng)力儀照射，光源距離15cm，波長630nm，光照密度為100mW/cm2,光照時(shí)間分別為100s、200s、400s、800s

3、、1200s（即光照能量分別為10J/cm2、20J/cm2、40J/cm2、80J/cm2、120J/cm2）。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，采用CCK8法檢測增殖活性，選出最優(yōu)光敏劑濃度+光照能量組合（ALA濃度為4.0mmol/L,PDT能量為80J/cm2）用于實(shí)驗(yàn)。
　　3.將傳代培養(yǎng)的生長情況良好的KFB分為4組，即空白對照組，ALA+PDT組（AP組），p79350（p38 MAPK信號(hào)通路激動(dòng)劑）+ALA+PDT組（PAP組）

4、，SB203580（p38 MAPK信號(hào)通路阻斷劑劑）+ALA+PDT組（SB組）；正常皮膚成纖維細(xì)胞組標(biāo)記為HSFs組，以ALA濃度為4.0mmol/L，PDT能量為80J/cm2（最優(yōu)光敏劑濃度+光照能量組合）進(jìn)行干預(yù)KFB各分組，流式細(xì)胞儀檢測各組FB細(xì)胞周期中細(xì)胞分布比例；Western Blot法檢測各組中細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、磷酸化p38細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶（phospho-p38mitogen-activ

5、ated protein kinase,p-p38 MAPK）表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.組織塊接種成功后約7天可見細(xì)胞形態(tài)呈長梭形或三角形，邊緣向外伸出數(shù)個(gè)突起；抗波形蛋白抗體免疫鑒定為陽性，證實(shí)其為成纖維細(xì)胞。
　　2.CCK8檢測結(jié)果顯示：ALA-PDT干預(yù)后，KFB活性受到抑制，且在一定的范圍中，KFB的活性隨著ALA濃度、PDT能量的增大而降低。
　　3.流式細(xì)胞儀檢測提示：五組細(xì)胞均以G0/G1期

6、細(xì)胞為主峰，空白對照組中細(xì)胞S期峰值高于HSFs組，S期細(xì)胞比例顯著增高（49.32+2.8％），PI具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；AP組、PAP組、SB組中S期峰值均低于空白對照組，S期細(xì)胞比例顯著降低，分別為（20.26+2.5%、24.45+2.3%、16.97+2.6%）,PI具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；AP組中S期細(xì)胞峰值高于SB組（16.97+2.6%)，低于PAP組（24.45+2.3%)，PI具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0

7、.05）。
　　4.Western Blot法檢測提示：空白對照組中Cyclin D1表達(dá)明顯高于HSFs，AP組、PAP組、SB組中Cyclin D1、p-p38MAPK表達(dá)顯著低于空白對照組，AP組中CyclinD1、p-p38MAPK表達(dá)高于SB組，低于PAP組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. p-p38 MAPK/Cyclin D1在KFB中的異常表達(dá)可導(dǎo)致成纖維細(xì)胞的異常增殖；<