人牙周膜成纖維細胞中膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達及尼古丁對其表達的影響.pdf

1、吸煙損傷牙周組織，是慢性牙周炎的主要危險因素。吸煙人群牙周炎的發(fā)病率遠遠高于非吸煙人群，并且在牙周炎患者中，吸煙人群的牙周組織破壞更加明顯。尼古丁作為煙草中的主要生物堿，除可直接損傷牙周組織外，還可通過影響牙周組織免疫系統(tǒng)的正常功能加速其損傷，但確切作用機制尚未明了。
　　研究發(fā)現(xiàn)，膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltransferase，ChAT)在尼古丁損傷機體過程中發(fā)揮重要作用。為觀察人牙周膜成纖維細胞(Perio

2、dontal ligament fibroblast，PDLF)中ChAT的表達，并探討在尼古丁對人PDLF中ChAT損傷過程中的作用，本研究通過建立尼古丁作用下人PDLF體外實驗?zāi)Ｐ停捎肦T-PCR，DNA測序和免疫組化等方法，觀察人PDLF中是否存在ChAT及在尼古丁作用下其表達的改變。旨在探討ChAT在吸煙相關(guān)性牙周炎發(fā)生發(fā)展中的作用，為尋找新的牙周炎防治途徑提供理論和實驗依據(jù)。
　　1．人牙周膜成纖維細胞中ChAT的表達

3、
　　取12-18歲志愿者正畸減數(shù)拔除的健康第一前磨牙，刮取根中1/3處牙周膜組織，改良組織塊法原代培養(yǎng)PDLF，鑒定，傳代，4-6代細胞用于實驗。采用免疫熒光及RT-PCR方法檢測人PDLF中ChAT的表達。免疫熒光結(jié)果顯示人PDLF胞漿中存在ChAT的陽性表達；RT-PCR結(jié)果顯示在與陽性對照組相同位置299bp處可見陽性條帶，且經(jīng)克隆測序證實擴增產(chǎn)物為ChAT。初步證實，在人PDLF中存在ChAT蛋白及mRNA表達。

4、　　2．尼古丁對人牙周膜成纖維細胞中ChAT表達的影響
　　第4代人PDLF隨機分為兩組，對照組：5％新生牛血清DMEM培養(yǎng)液；實驗組：尼古丁硫酸鹽(10-12mol/L)溶于含5％新生牛血清DMEM培養(yǎng)液。37℃、5％CO2孵箱中孵育24h。RT-PCR、實時定量PCR及免疫熒光方法檢測尼古丁對人PDLF中ChAT表達的影響。
　　免疫熒光結(jié)果顯示，正常及尼古丁作用下人PDLF存在ChAT陽性表達，表達主要位于胞漿。與對照

5、組相比，尼古丁作用24h后，實驗組人PDLF中ChAT陽性信號增強。RT-PCR結(jié)果表明，與對照組相比，尼古丁作用24h后人PDLF中PCR擴增產(chǎn)物ChATmRNA陽性表達增強；經(jīng)quantityone分析，表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05），實時定量PCR進一步證實該結(jié)果。
　　以上結(jié)果證實，人PDLF中存在ChAT蛋白、mRNA表達；尼古丁可明顯上調(diào)其表達。由此推測ChAT可能為尼古丁在牙周組織的作用靶點，在吸煙相關(guān)性牙