超聲微泡介導人骨形成蛋白-2基因在人牙周膜成纖維細胞中的表達.pdf

1、近年來以生長因子局部應用為代表的牙周再生治療受到廣泛關注和研究。骨誘導形成蛋白.2（BMP2）是唯一能夠單獨誘導成骨的生長因子，在牙周組織中的分子調節(jié)作用也已經比較明確。它可誘導牙周組織中未分化間充質細胞分化為成骨細胞和成牙骨質細胞，對人牙周膜成纖維細胞（HPDLFs）具有成骨定向分化誘導作用，但局部直接使用時存在著易流失、效率低等問題。基因治療技術的應用可以使外源性的BMP2直接在宿主細胞內完成表達和后加工，減少全身的毒副作用，增強了

2、局部治療效果，為牙周組織再生提供了廣闊的研究前景。導入方法的選擇是決定基因治療效果的關鍵因素。超聲微泡轉基因技術作為一種新型的、安全有效的基因轉染方法，目前已應用于心臟、血管、肝臟、腎臟、骨骼肌、眼等領域的基因轉染實驗研究中，已有大量研究表明，超聲介導微泡造影劑破裂可增強目的基因在體內外的轉染與表達。但該技術用于人牙周組織的報道較少，本課題以hBMP2為目的基因將超聲微泡轉基因技術用于轉染HPDLFs，并觀察轉染后目的基因在HPDLFs

3、中的表達情況，為該技術在牙周再生基因治療方面的進一步研究奠定實驗基礎。
　　 目的：
　　 構建帶有目的基因hBMP2的真核表達載體pEGFP-N1-BMP2，然后利用超聲微泡轉基因技術將其轉入HPDLFs，并檢測轉染后目的基因的表達情況。
　　 方法：
　　 1.采用組織塊法原代培養(yǎng)HPDLFs，通過形態(tài)學及免疫組織化學鑒定后，進行傳代培養(yǎng)，取3～5代細胞用于實驗。
　　 2.根據Genbank

4、數據庫中hBMP2的cDNA序列（Gen-Bank，Accession No.NMOO1200），利用Primer Premier5設計軟件設計并合成引物，從人胎盤滋養(yǎng)層細胞系中提取總RNA，采用RT-PCR方法獲得hBMP2基因，連接pMDl9-T載體后，轉化大腸桿菌DH5a并篩選陽性克隆，經酶切鑒定及測序正確后，用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內切酶分別雙酶切pMD19-T-BMP2與pEGFP-N1質粒，再將回收、純化后的BMP2基

5、因和pEGFP-N1質粒進行連接、轉化，篩選pEGFP-N1-BMP2的陽性克隆，鑒定正確后用于后續(xù)實驗。
　　 3.利用超聲微泡轉基因技術，在聲強為0.5 w/cm2，間斷波輻照時間60 s，微泡濃度為15％的條件下將重組質粒pEGFP-N1-BMP2轉入HPDLFs中，同時以在相同條件下轉染空質粒pEGFP-N1組及未轉染組做對照，通過熒光顯微鏡，RT-PCR和免疫熒光技術分別檢測轉染后HPDLFs中BMP2的表達情況。

6、r>　　 結果：
　　 1.牙周膜成纖維細胞原代培養(yǎng)成功并傳代。
　　 2.成功克隆人BMP2基因，構建了真核表達載體pEGFP-N1-BMP2。
　　 3.超聲微泡轉基因技術在適當的條件下可將攜帶目的基因BMP2的重組質粒pEGFP-N1-BMP2成功轉入HPDLFs；經RT-PCR及免疫熒光檢測顯示，與對照組相比pEGFP-N1-BMP2轉染組中BMP2在HPDLFs內的瞬時表達明顯增強。
　　 結