PiggyBac轉座子介導外源基因在豬成纖維細胞及胚胎中表達研究.pdf

1、轉基因動物是指以實驗方法導入外源基因,在染色體組內穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類動物。轉基因動物有非常重大的生產和科研作用。轉基因動物是對多種生命現(xiàn)象本質深入了解的工具,如研究基因的結構與功能的關系,細胞發(fā)育的潛能性,細胞核與細胞質的相互關系,胚胎發(fā)育調控,腫瘤,神經與發(fā)育等;并可以用來建立多種疾病的動物模型,進而研究這些疾病的發(fā)病機理及治療方法;還能提高動物育種效率。另外轉基因動物可作為醫(yī)用或食用蛋白的生物反應器。但是目前轉基因動物的生

2、產也遇到了一些問題,比如利用質粒的隨機整合得到的轉基因動物在傳代過程中會出現(xiàn)外源基因的丟失,位置效應和甲基化的影響會造成外源基因表達效率的下降;病毒感染體系中病毒滴度和隨之產生的輔助病毒限制了其在臨床和生產上的應用,因此,尋找到一個合適的轉基因載體是轉基因動物生產的重要環(huán)節(jié)。本研究利用來自鱗翅目昆蟲的piggyBac轉座子作為轉基因載體,將外源基因(EGFP和Follistatin)導入到豬的胎兒成纖維細胞,并將攜帶轉座子的轉基因細胞作

3、為核移植供體細胞進行核移植,得到轉基因的豬核移植胚胎,系統(tǒng)的評價了piggyBac轉座子作為轉基因載體在豬的轉基因生產中的優(yōu)缺點,為piggyBac轉座子應用于豬的轉基因生產奠定基礎。本研究得到的實驗結果如下:
　　 1細胞分別轉染piggyBac轉座子體系和pEGFP-C1隨機整合體系,兩個轉染體系在12小時和48小時的時候,EGFP的表達沒有差異,但是在轉染24小時的時候,隨機整合體系的EGFP表達比piggyBac轉座子體

4、系EGFP表達高,而且差異顯著。
　　 2細胞篩選10天后,進行形成的細胞集落計數(shù),并將計數(shù)結果進行統(tǒng)計分析,來表示兩種不同轉染體系的穩(wěn)定轉染效率。結果發(fā)現(xiàn)piggyBac轉座子體系得到的細胞集落數(shù)是pEGFP-C1體系得到的細胞集落數(shù)的18倍,差異顯著。
　　 3利用基因組步移技術檢測了piggyBac轉座子5'端旁側序列。測序結果顯示,所有的轉座子片段都是以轉座的方式整合到基因組上的,插入的都是TTAA四核苷酸位點,

5、沒有發(fā)現(xiàn)隨機整合的現(xiàn)象。
　　 4將基因組步移得到的片段和豬的基因組進行比對,以驗證piggyBac轉座子的插入位點信息。由于目前豬的基因組全序列還不完整,還無法完全得知這些片段的插入位點。但是仍然在豬的2,9,15號染色體上發(fā)現(xiàn)了同源序列。
　　 5為了檢測piggyBac轉座子介導的外源基因在豬基因組上的拷貝數(shù),利用southernblot檢測外源基因的拷貝數(shù)。結果表明轉座子可以介導外源基因在豬基因組上的多拷貝整合。

6、
　　 6為了檢測轉座和隨機整合兩種方式得到的轉基因細胞中外源基因的表達量,Real-TimePCR用來檢測兩種細胞中外源基因的表達。結果表明,piggyBac轉座子能高效的介導外源基因在豬體細胞中的表達,且表達量是隨機整合法的4倍。
　　 7為了檢測兩種細胞中外源基因的表達量差異是否和啟動子的甲基化有差異,我們分析了細胞傳代過程中外源基因啟動子CMV的甲基化變化。結果發(fā)現(xiàn)兩種細胞中外源基因啟動子的甲基化情況沒有改變。<

7、br>　　 8不同比例的、的轉座子供體質粒和輔助質粒轉染細胞并G418篩選10天后,統(tǒng)計每一組得到的陽性細胞集落數(shù)。結果發(fā)現(xiàn),當供體質粒和輔助質粒的比例在1:4之前時,陽性細胞集落數(shù)隨輔助質粒量得增加而增加,但當該比例到1:5的時候,陽性細胞集落數(shù)顯著下降。
　　 9為了檢測piggyBac轉座酶對豬胎兒成纖維細胞增殖造成的影響,用CCK-8試劑盒檢測不同量得轉座酶對細胞增殖的影響。結果表明piggyBac轉座酶影響豬胎兒成纖

8、維的增殖,尤其是當轉座酶和pEGFP-C1質粒共轉染細胞時,細胞的增殖效率顯著下降。
　　 10攜帶有piggyBac轉座子和pEGFP-C1隨機整合的細胞作為核移植的供體細胞進行核移植后,檢測核移植胚胎的卵裂率,囊胚率和囊胚細胞數(shù)。結果表明,無論是piggyBac轉座還是pEGFP-C1的隨機整合,核移植胚胎的卵裂率,囊胚率和囊胚細胞數(shù)都沒有顯著差異。表明piggyBac轉座不影響核移植胚胎的發(fā)育。
　　 11為了比較

9、兩種轉染體系在核移植胚胎中是否能有效介導外源基因的表達,利用Real-TunePCR檢測了兩種供體細胞來源的核移植胚胎中的外源基因EGFP的表達,結果表明piggyBac轉座子能高效介導外源基因的表達,而且表達量是隨機整合體系介導的外源基因表達量得17倍。
　　 12在轉基因細胞的生長過程中,follistatin表達的豬胎兒成纖維細胞發(fā)生了形態(tài)上的改變,細胞變長變細,并且可以呈克隆狀生長。Follistatin的表達引起了豬胎