豬Nangog基因在成纖維細(xì)胞與克隆胚胎中的過表達(dá)研究.pdf

1、Nanog是在早期胚胎發(fā)育和干細(xì)胞多能性維持中起到關(guān)鍵作用的基因之一。在大型哺乳動物中,有關(guān)Nanog基因功能的研究甚少。原因之一是目前為止仍未建立起真正的胚胎干細(xì)胞系并且缺乏類似在小鼠和人胚胎干細(xì)胞中對相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)致研究。豬是人類重要的疾病模型和器官供給者,對豬的研究不僅對畜牧業(yè)的發(fā)展有很大的促進作用,而且對醫(yī)學(xué)的研究也起著至關(guān)重要的作用。因此,在豬上對干細(xì)胞多能性基因的功能探索便顯得尤為重要。本研究通過遺傳修飾的方法,從豬MⅡ期

2、卵母細(xì)胞的RNA中克隆了與多能性維持緊密相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Nanog的全長cDNA,并將其導(dǎo)入豬胎兒成纖維細(xì)胞,獲得了過表達(dá)Nanog的細(xì)胞系,之后利用轉(zhuǎn)基因的供核細(xì)胞構(gòu)建出克隆胚胎并加以研究,試圖對豬Nanog基因功能進行初步探索。經(jīng)過實驗得到了以下研究成果:
　　 (1)本研究通過RT-PCR方法從豬MⅡ期卵母細(xì)胞總RNA中克隆了豬Nanog基因全長cDNA,序列分析表明該段基因由915個核苷酸堿基組成,與NCBI上豬Nanog

3、編碼序列進行BLAST比對分析同源性達(dá)98％,只有第562位堿基發(fā)生了錯義突變(A→G)和572位堿基突變(G→A),編碼氨基酸分別由天冬氨酸(Asp)突變?yōu)樘K氨酸(Thr),天冬酰胺(Asn)突變?yōu)樯彼?Ser)。
　　 (2)成功構(gòu)建了pEGFP-C1/Nanog和pcDNA3.1(+)/Nanog真核表達(dá)重組質(zhì)粒,在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染皮膚成纖維細(xì)胞,分別獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和瞬時轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,免疫熒光結(jié)果表明Nanog蛋白可成功表達(dá)

4、于成纖維細(xì)胞核內(nèi)。
　　 (3)對表達(dá)GFP-NANOG融合蛋白的細(xì)胞,熒光鑒定結(jié)果表明無論是穩(wěn)定或是瞬時表達(dá)的GFP-NANOG融合蛋白均位于細(xì)胞核內(nèi)。
　　 (4)轉(zhuǎn)染有pEGFP-C1/Nanog和pcDNA3.1(+)/Nanog重組質(zhì)粒的豬胎兒成纖維細(xì)胞在G418篩選多天后均有若干干細(xì)胞樣克隆形成。
　　 (5)豬胎兒成纖維細(xì)胞瞬時過表達(dá)Nanog基因后可瞬時激活Oct4,C-myc和Sall4至5倍,

5、2倍和5倍。
　　 (6)豬胎兒成纖維細(xì)胞瞬時過表達(dá)Nanog可瞬時激活JAK/STAT3通路(LIF,LIFr,Gp130)和下游激活基因(Stat3,C-myc)。
　　 (7)經(jīng)懸浮培養(yǎng),穩(wěn)定表達(dá)Nanog的成纖維細(xì)胞能形成典型的類胚體,RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)這些類胚體表達(dá)三個胚層分化標(biāo)志基因。
　　 (8)經(jīng)過G418篩選的穩(wěn)定表達(dá)Nanog的體細(xì)胞,并不能維持多能性和信號通路相關(guān)基因的激活狀態(tài)。
　

6、　 (9)核移植實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)未進行轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞和分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)空載體、pcDNA3.1(+)/Nanog載體的成纖維細(xì)胞所構(gòu)建的克隆胚胎在卵裂率、融合率、囊胚率上差異不顯著,說明表達(dá)多能性轉(zhuǎn)錄因子Nanog的成纖維細(xì)胞與未經(jīng)遺傳修飾成纖維細(xì)胞所構(gòu)建的克隆胚胎具有同樣的發(fā)育潛能.
　　 (10)在克隆胚胎中高表達(dá)的Nanog基因可以在桑葚胚期激活內(nèi)源Oct4,Sox2和Nanog基因表達(dá)至159,93,和