四環(huán)素調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)調(diào)節(jié)LEF1基因在成纖維細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、本研究應(yīng)用四環(huán)素調(diào)控誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，以系統(tǒng)中的調(diào)控表達(dá)載體pcDNA4為基本骨架，選用角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白KAP6.1基因啟動(dòng)子為構(gòu)建最終表達(dá)載體的啟動(dòng)子，啟動(dòng)目的基因淋巴樣生長(zhǎng)因子LEF1基因。
　　四環(huán)素(tetracycline，Tet)調(diào)控誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的具有高效、嚴(yán)密開(kāi)關(guān)功能的基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，誘導(dǎo)物是四環(huán)素或四環(huán)素衍生物，通過(guò)誘導(dǎo)物可以從時(shí)空角度上特異性地控制外源基因在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用T

2、et-on系統(tǒng)，構(gòu)建四環(huán)素調(diào)控淋巴樣生長(zhǎng)因子基因(LEF-1)表達(dá)的表達(dá)載體，并與Tet-on系統(tǒng)中的誘導(dǎo)表達(dá)載體pcDNA6共轉(zhuǎn)染絨山羊胎兒皮膚成纖維細(xì)胞。通過(guò)四環(huán)素誘導(dǎo)來(lái)檢測(cè)LEF1基因在mRNA水平的表達(dá)量。
　　下圖是對(duì)四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)的簡(jiǎn)單介紹:
　　四環(huán)素誘導(dǎo)調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)主要包括調(diào)控表達(dá)載體pcDNA4和反應(yīng)表達(dá)載體pcDNA6兩種質(zhì)粒。調(diào)控表達(dá)載體pcDNA4主要由啟動(dòng)子，操縱序列和目的基因組成;反應(yīng)表達(dá)載體pc

3、DNA6通過(guò)啟動(dòng)子表達(dá)阻遏蛋白TetR。將pcDNA4和pcDNA6兩質(zhì)粒通過(guò)共轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的細(xì)胞后，pcDNA6載體表達(dá)的阻遏蛋白TetR與表達(dá)載體pcDNA4上的操縱序列結(jié)合，阻遏了目的基因的表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液中四環(huán)素Tet或四環(huán)素衍生物強(qiáng)力霉素(DOX)存在時(shí)，可與pcDNA4的操縱序列結(jié)合，從而引起阻遏蛋白TetR構(gòu)想發(fā)生變化，從操縱序列上脫落下來(lái)，最終誘導(dǎo)目的基因的轉(zhuǎn)錄。KAP6.1基因啟動(dòng)子片段及LEF1基因片段的

4、獲得是通過(guò)PCR擴(kuò)增法，分別以現(xiàn)有的表達(dá)載體pcDsRed2-KV和載體pCDsRed2-KL為模板，使用LATAqDNA聚合酶合成相應(yīng)片段。將四環(huán)素調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)載體pcDNA4/TO通過(guò)相應(yīng)限制性?xún)?nèi)切酶酶切，以及T4連接酶將目的片段連接后，得到的新的載體為修改后的載體，與原pcDNA4/TO載體相比，刪除了部分序列。然后用PCR擴(kuò)增出的角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白KAP6.1基因啟動(dòng)子片段替換載體中的原始啟動(dòng)子CMV片段，淋巴樣生長(zhǎng)因子Ⅰ(

5、LEF1)片段插入修改后的表達(dá)載體pcDNA的多克隆位點(diǎn)(MCS)。實(shí)驗(yàn)在構(gòu)建載體pcDNA4-KL的過(guò)程中，角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白KAP6.1基因啟動(dòng)子與pMD19T連接，重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶酶切電泳，發(fā)現(xiàn)片段大小及連接都正確。從而可以進(jìn)一步檢測(cè)片段序列，更好行駛基因功能，發(fā)揮在載體上的作用。挑選重組質(zhì)粒并編號(hào)委托上海生工生物有限公司測(cè)序，應(yīng)用生物專(zhuān)用軟件genebank，查找LEF1基因序列，與測(cè)序結(jié)果相比對(duì)，結(jié)果證明正確。淋巴樣生長(zhǎng)因

6、子Ⅰ(LEF1)片段的檢測(cè)與KAP6.1啟動(dòng)子片段一樣，結(jié)果證明也正確。將測(cè)序正確的pMD19-TK與修改后的pcDNA4兩質(zhì)粒用NdeI和MluI兩限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切后，用T4連接酶連接相應(yīng)的目的片段，經(jīng)過(guò)酶切鑒定KAP6.1基因啟動(dòng)子片段正確連入載體pcDNA4啟動(dòng)子區(qū)域，得到載體pcDNA4-K。BamHI和EcoRI兩限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切pMD19T-L和pcDNA4-K，T4連接酶連接相應(yīng)的目的片段，經(jīng)酶切鑒定LEF1基因片段正

7、確插入載體pcDNA4-K的MCS位點(diǎn)上。為下一步與四環(huán)素調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)載體pcDNA6共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。
　　2.胎兒皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)及共轉(zhuǎn)染
　　在體外分離培養(yǎng)胎兒皮膚成纖維細(xì)胞，并且進(jìn)行雙載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。配置含有10％FBS的DMEM/F12的細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)原代胎兒皮膚成纖維細(xì)胞，于37℃、5％CO2飽和濕度條件下培養(yǎng);當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)皿后，冷凍保存細(xì)胞。配置細(xì)胞冷凍保存液，即10％DMSO+

8、90％FBS。利用脂質(zhì)體LipoftaecmineTM介導(dǎo)法，將表達(dá)載體pcDNA4-KL和誘導(dǎo)表達(dá)載體pcDNA6共轉(zhuǎn)染絨山羊第二代胎兒成纖維細(xì)胞，用合適的抗生素Blasticidin和博萊霉素Zeocin兩種抗生素濃度共同篩選細(xì)胞，篩選12后得到單克隆細(xì)胞。0.25％胰酶消化單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)整個(gè)皿后，提取其基因組DNA，進(jìn)行PCR鑒定。Blasticidin濃度為13μg/ml及Zeocin濃度為1500μg/ml的兩

9、種抗生素共同篩選12天，獲得單克隆細(xì)胞。利用克隆杯胰酶消化法，將單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，用普通基因DNA提取試劑盒提取細(xì)胞基因組DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增電泳鑒定表達(dá)載體pcDNA4-KL已與細(xì)胞基因組穩(wěn)定整合，同時(shí)表達(dá)載體pcDNA6與細(xì)胞基因組也穩(wěn)定整合?？梢赃M(jìn)行下一步的四環(huán)素誘導(dǎo)及檢測(cè)。
　　3.四環(huán)素誘導(dǎo)目的基因LEF1在皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)
　　設(shè)置誘導(dǎo)物四環(huán)素(Tet)在不同濃度(0ug/ml，1ug/ml，10ug/m