嚴密型四環(huán)素調控系統(tǒng)的細胞模型及轉基因動物模型的建立.pdf

1、動物轉基因技術是在上世紀八十年代初發(fā)展起來的一項高新生物技術。1982年，Palmite等將小鼠金屬硫蛋白(MT-1)基因啟動子片段，與大鼠生長激素基因相連接的融合基因轉入小鼠受精卵，培育出體重是一般小鼠2倍大的超級小鼠，引起了世界轟動。隨著世界各國普遍開展轉基因動物的研究，轉基因技術也得到了飛速發(fā)展。轉基因動物在生命科學研究的重要應用從而得以證實。 與普通的轉基因技術相比，條件轉基因技術使轉基因動物的制作有了革新性的發(fā)展，它

2、克服了普通轉基因技術的一些局限性。例如某些基因在動物成體內具有致病或毒性作用，采用傳統(tǒng)技術制作帶有這類基因的轉基因動物時，由于在胚胎期外源基因就可以表達，導致動物在胚胎時期發(fā)生死亡而無法進行深入研究或者形成免疫耐受，因而作為疾病模型用來探討免疫反應及致病機制顯然不是很理想。可調控基因表達的調控系統(tǒng)基本上都包括三個組成部分，即調控部分，攜帶目的基因的反應部分和誘導因子部分，其目的是在細胞或動物整體水平實現(xiàn)對外源基因表達的時空調控，其中Bu

3、jard和其同事建立的四環(huán)素調控系統(tǒng)即Tet-off/Tet-on系統(tǒng)是目前較完善的最具代表性的基因表達調控系統(tǒng)之一(GossenandBujardetal，1992；Gossenetal，1995)，目前已成功地用于轉基因動物模型的研究(Huangetal，2001；Efratetal，1995；Diamondetal，2000)。 四環(huán)素調控系統(tǒng)的推出為研究基因功能及誘導表達開辟了一個嶄新的領域，它為研究系統(tǒng)發(fā)育中基因的調

4、控表達和功能、某些特定基因在不同生長過程中的生物學作用、生化特征提供了理想的研究工具，為基因治療提供了一條可控的安全途徑。然而，其自身存在的一些問題，例如泄漏，使其在應用上受到一些限制，特別在某些基因的表達對細胞或胚胎具有毒性或引起免疫耐受時，當需要定時定量研究基因表達等情況下，該系統(tǒng)就顯得不夠適合。 為建立嚴密型四環(huán)素調控系統(tǒng)的細胞模型和動物模型，本實驗構建了帶有肝臟特異性啟動子ApoE的rtTA/tTS片段，用脂質體法轉染

5、人HepG2細胞和顯微注射制作ApoE-rtTA-tTS轉基因動物。經(jīng)過檢測熒光素酶的活性，獲得了一株低背景表達和高誘導倍數(shù)的HepG2細胞克隆。PCR和Southernblot二級篩選法獲得兩只基因組中整合有ApoE-rtTA-tTS的首建轉基因鼠。RT-PCR結果顯示，rtTA/tTS僅僅在肝臟有特異的轉錄表達，其他組織不表達。熒光素酶活性檢測結果進一步驗證了tTS對四環(huán)素調控系統(tǒng)的內在泄露問題有一定的抑制作用，使四環(huán)素調控系統(tǒng)可以

6、對基因表達進行時間和數(shù)量水平上的有效調控，使該系統(tǒng)不僅能用于培養(yǎng)細胞的基因表達的研究，還可以用于轉基因動物，作為基因功能及基因調控的主要工具。另外本調控系統(tǒng)帶有肝臟特異性啟動子，能使外源基因在肝臟定點表達，對某些肝臟疾病的發(fā)病機理以及藥物治療的研究均有十分重要的意義。 當把本研究建立的帶有調控部分的模型小鼠，與整合有四環(huán)素調控系統(tǒng)反應部分的小鼠雜交后，可獲得帶有四環(huán)素調控系統(tǒng)兩種組分的雙轉基因小鼠。在特定的時間內通過在飲水中加