人MAN2C1轉(zhuǎn)基因動物模型的建立及相關(guān)研究.pdf

1、MAN2C1是本實驗室克隆的cDNA編碼的1個人α-甘露糖苷酶。我們原先稱它為6A8α-甘露糖苷酶。國際已命名此酶為mannosidase，alpha，class2C，member1[Homosapiens]，簡稱MAN2C1。其相應(yīng)的基因位于染色體15q11-q13。HUGO基因命名委員會命名此基因為MAN2C1。MAN2C1的分子量在非糖基化情況下為～116kDa。 為研究MAN2C1的生物學(xué)意義，本實驗室用反義技術(shù)抑制MA

2、N2C1基因在細(xì)胞中的表達(dá)，觀察到：人B淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞株BJAB發(fā)生腫脹樣死亡；人T淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat細(xì)胞間黏附增強(qiáng)，包括CD54和LFA-1等不少黏附分子及與黏附相關(guān)的分子的表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞的骨架蛋白發(fā)生重排；EB病毒轉(zhuǎn)化的人B細(xì)胞SKW6對抗-Fas抗體誘導(dǎo)的凋亡發(fā)生抵抗；人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2L2的惡性生物學(xué)行為(腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移)減弱，細(xì)胞間的黏附增強(qiáng)，細(xì)胞的E-鈣黏蛋白表達(dá)增高，細(xì)胞的端粒變短。但是，要深入了解MAN2C

3、1的生物學(xué)意義，除了進(jìn)一步研究MAN2C1基因表達(dá)對多種細(xì)胞生物學(xué)行為的影響外，還必須在整體水平作研究。這包括制備轉(zhuǎn)基因動物和基因敲除動物。本碩士論文工作的目的是制備轉(zhuǎn)人MAN2C1基因小鼠。我構(gòu)建了表達(dá)載體pIRES2-EGFP-MAN2C1，熒光檢測表明它轉(zhuǎn)入細(xì)胞后能表達(dá)插入的基因。為使基因整合入基因組的效率增高，把pIRES2-EGFP-MAN2C1切成線狀。轉(zhuǎn)染細(xì)胞的實驗表明，線性化對基因的表達(dá)沒有影響。轉(zhuǎn)基因小鼠在北京實驗動物

4、中心制備。得到小鼠后，用基因組PCR檢測MAN2C1基因整合入小鼠基因組的情況。在北京實驗動物中心提供的116只小鼠中，共檢測到8只陽性小鼠。經(jīng)配對繁殖得到F1代小鼠?；蚪MPCR檢測見～1/2小鼠為陽性。陽性F1代小鼠合籠在F2代有～3/4小鼠陽性。用RT-PCR檢測了MAN2C1基因在轉(zhuǎn)基因鼠尾部組織中的轉(zhuǎn)錄，在7個系的小鼠中有4個為MAN2C1mRNA陽性。為作Western印跡檢測，我在原核細(xì)胞表達(dá)了MAN2C1分子的中的gly

5、co_hydro_38結(jié)構(gòu)域蛋白，用它免疫小鼠，制備了抗MAN2C1的單克隆抗體3B10。用單克隆抗體3B10作探針，取小鼠尾部組織，提取蛋白質(zhì)，Western印跡檢測見這4個系的小鼠為陽性。這表明，我已成功地制備了轉(zhuǎn)MAN2C1基因小鼠。我對轉(zhuǎn)MAN2C1基因小鼠與對照小鼠的胸腺、脾臟、骨髓及小腸作了組織學(xué)比較，未發(fā)現(xiàn)明顯差異。我還比較了轉(zhuǎn)MAN2C1基因小鼠與對照小鼠小腸上皮細(xì)胞的增殖情況，也未發(fā)現(xiàn)明顯差異。 本論文工作還構(gòu)