Plcd1轉基因小鼠的建立.pdf

1、PLCD1是Plcd1基因編碼的蛋白，屬于磷脂酶C家族δ亞型，在磷酸肌醇代謝和Ca2+平衡中發(fā)揮重要作用。我們的目標是建立Plcd1轉基因小鼠，結合前期本實驗室自主培育的Plcd1缺失小鼠snthr-1Bao，在整體動物水平研究Plcd1的生物學功能。本實驗從Plcd1表達載體的構建和顯微注射法制備Plcd1轉基因小鼠兩個方面介紹如下：
　　 第一部分pEF6/V5-His-Plcd1真核表達載體的構建。
　　 目的：擴

2、增Plcd1目的基因片段，獲得能在哺乳動物細胞中表達PLCD1融合蛋白的表達載體。方法：通過RT-PCR方法獲得Plcd1目的片段，將其與pMD19-T載體連接、轉化DH5α感受態(tài)細胞，經藍白斑篩選、PCR檢測及DNA測序，獲得pMD19-T-Plcd1重組質粒；以重組質粒為模板，通過引物設計及PCR方法在Plcd1目的基因兩端引入合適的酶切位點，將純化的PCR產物和pEF6/V5-His-LacZ表達載體分別進行酶切、純化、回收、連接

3、、轉化DH5α感受態(tài)細胞，再經Amp篩選、PCR檢測及DNA測序，獲得pEF6/V5-His-Plcd1表達載體；在此基礎上，通過電轉染的方法，將pEF6/V5-His-Plcd1表達載體導入L929細胞，經間接免疫熒光法檢測PLCD1融合蛋白的表達。結果：本實驗成功擴增了長2271bp的Plcd1目的片段，將其與pMD19-T載體連接獲得了pMD19-T-Plcd1克隆載體；以克隆載體為模板，通過PCR方法分別在Plcd1目的基因上下

4、游引入了SpeI和BstBI兩個酶切位點，PCR產物與pEF6/V5-His-Lac Z經酶切、回收、連接、轉化、篩選及測序等一系列步驟，最終獲得了pEF6/V5-His-Plcd1表達載體；電轉染L929細胞后，經間接免疫熒光法檢測到PLCD1融合蛋白在細胞質中表達。結論：本實驗成功擴增了全長2271bp的Plcd1目的片段，并先后構建了pMD19-T-Plcd1克隆載體及能在哺乳動物細胞中表達融合蛋白的pEF6/V5-His-Plc

5、d1表達載體。
　　 第二部分顯微注射法制備Plcd1轉基因小鼠。
　　 目的：在成功獲得pEF6/V5-His-Plcd1表達載體的基礎上，通過顯微注射法獲得Plcd1轉基因小鼠。方法：pEF6/V5-His-Plcd1表達載體經酶切、電泳、純化后，選擇包括hEF-1α啟動子、Plcd1目的片段、V5、His-tag和BGH的線性構件用于顯微注射；供體、受體小鼠經同步發(fā)情或超排卵處理，采集受精卵用于顯微注射；經顯微注射

6、后的受精卵適當培養(yǎng)，選擇優(yōu)質胚胎進行受體小鼠的輸卵管移植；出生小鼠經基因組DNA提取及PCR檢測，初步確認獲得Founder轉基因小鼠。結果：pEF6/V5-His-Plcd1經NruI和AseI雙酶切純化后，成功獲得了用于顯微注射的目的片段；顯微注射共681枚受精卵，經培養(yǎng)后多數溶解，僅存活優(yōu)質胚胎393枚，存活率為57.7％；存活胚胎全部用于移植，共移植了18只受體小鼠，13只小鼠懷孕，獲得82只仔鼠。經PCR初步檢測，成功獲得了1