甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-2轉(zhuǎn)基因小鼠模型建立及其對腭融合的影響.pdf

1、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-2(TTF-2)是由titf2/foxel基因編碼，為僅含有一個(gè)外顯子的基因，全長為2807bp，定位于鼠4C2。TTF-2蛋白在個(gè)體發(fā)生中的表達(dá)具有高度組織特異性和發(fā)育階段特異性，其表達(dá)受激素和細(xì)胞因子調(diào)節(jié)控制。 TTF-2蛋白具有雙向調(diào)節(jié)作用，即TTF-2蛋白的轉(zhuǎn)錄活化作用和轉(zhuǎn)錄抑制作用。TTF-2蛋白通過其叉頭DNA結(jié)合域與編碼甲狀腺過氧化物酶(TPO)和甲狀腺球蛋白(Tg)基因的啟動(dòng)子的特殊DNA調(diào)節(jié)序列

2、結(jié)合，調(diào)節(jié)Tg和TPO轉(zhuǎn)錄；TTF-2蛋白通過羧基末端抑制結(jié)構(gòu)域與甲狀腺特異性基因有關(guān)的輔助因子(TTF-1、PaX-9)相互作用，特異性抑制其轉(zhuǎn)錄活化，是啟動(dòng)子特異性轉(zhuǎn)錄抑制子。 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是將外源基因引入基因組的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，它主要目的是把外源DNA導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞核內(nèi)改變動(dòng)物遺傳性狀，是從四維時(shí)空觀察轉(zhuǎn)基因的整體效應(yīng)，是將外源基因轉(zhuǎn)移從細(xì)胞水平到機(jī)體水平的一大飛躍。利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)可以建立人類疾病相關(guān)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，以

3、探討目的基因的表達(dá)調(diào)控規(guī)律。 titf-2-/-小鼠和人類titf-2基因純合缺陷表現(xiàn)為腭裂及甲狀腺發(fā)育不全等畸形。說明titf-2基因與腭發(fā)育有密切關(guān)系。但是，目前仍不清楚TTF-2如何控制腭突形成，為詳盡觀察titf-2基因活動(dòng)規(guī)律和其表達(dá)產(chǎn)物(蛋白質(zhì))的作用，作者設(shè)想建立titf-2轉(zhuǎn)基因小鼠模型“正面”研究的TTF-2的功能。 因titf-2基因僅含有一個(gè)外顯子而無內(nèi)含子，本研究首先采取以基因組DNA為模板用PC

4、R方法擴(kuò)增目的基因片段，從titf-2基因593位點(diǎn)起始密碼子ATG開始至1705位點(diǎn)終止密碼子TGA結(jié)束，目的基因片段全長為1113bp。目的基因片段插入T載體，經(jīng)正反雙向測序檢驗(yàn)正確后，目的基因片段插入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物專用載體pBROAD3，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pBROAD3-titf-2。經(jīng)體外轉(zhuǎn)染小鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞表達(dá)實(shí)驗(yàn)證實(shí)本研究構(gòu)建的pBROAD3-titf-2可以在體外表達(dá)TTF-2蛋白，含有結(jié)構(gòu)基因表達(dá)所需的元件，完全符合用于轉(zhuǎn)

5、基因動(dòng)物的制備。隨后通過顯微注射法，將titf-2基因注射入小鼠受精卵雄原核，經(jīng)PCR和SouthernBlotting，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因陽性小鼠。 對轉(zhuǎn)基因胎鼠12、13、14、15天腭突TTF-2和TGFβ3表達(dá)的檢測表明：TTF-2在轉(zhuǎn)基因小鼠腭突中高表達(dá)，失去了其原有的時(shí)空變化規(guī)律強(qiáng)烈抑制了TGFβ3的表達(dá)，導(dǎo)致腭裂形成。 本研究中，我們制備了titf-2轉(zhuǎn)基因小鼠，該小鼠產(chǎn)生腭裂，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)TTF-2是通過