TGM6轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建和鑒定.pdf

1、脊髓小腦型共濟失調(diào)(spinocerebellar ataxia，SCA)是一種具有高度臨床和遺傳異質(zhì)性的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，多呈常染色體顯性遺傳。隨著分子遺傳學(xué)的研究進展，陸續(xù)鑒定出新的致病基因。到目前已發(fā)現(xiàn)了33個不同的基因亞型，其中23個亞型的致病基因已被克隆出來。2010年，我們實驗室應(yīng)用Exome sequencing技術(shù)在兩個無關(guān)的常染色體顯性遺傳家系中發(fā)現(xiàn)兩個不同位置的突變:TGM6基因10號外顯子的c.1550T-G(L

2、517W)突變和7號外顯子c.980A-G(D327G)突變。從而鑒定出一個新的SCA致病基因TGM6，該SCA新亞型被人類基因命名委員會正式命名為SCA35。
　　SCA各亞型致病基因的分子發(fā)病機制并不完全一樣。TGM6基因本身的生物學(xué)功能目前國內(nèi)外尚無研究報道。為了探討TGM6的基本生物學(xué)功能以及突變引起SCA35的發(fā)病機制，我們構(gòu)建兩種突變型和野生型TGM6基因的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，使小鼠表達人類突變和野生的TG6蛋白。此外，目

3、前缺乏TGM6基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的細胞水平表達譜的資料，而這些資料對于了解其功能是必需的。因此，本論文采用免疫組化方法調(diào)查了TGM6基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的分布情況及其陽性神經(jīng)元的化學(xué)神經(jīng)解剖學(xué)特征。
　　為了構(gòu)建攜帶人類L517W突變、D327G突變和野生型TGM6基因的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，首先構(gòu)建了pCAGGS-TGM6wt-Myc-GFP、pCAGGS-TGM6L517W-Myc-GFP和pCAGGS-TGM6D327G-Myc

4、-GFP三個轉(zhuǎn)基因表達載體。轉(zhuǎn)基因表達載體上帶了Myc和GFP兩個標(biāo)簽。這些載體在培養(yǎng)細胞進行了驗證。
　　在此基礎(chǔ)上，我們制備了以上表達人TGM6的三種轉(zhuǎn)基因小鼠:即L517W突變、D327G突變和野生型TGM6。以上小鼠通過PCR和測序驗證。應(yīng)用Western Blot檢測GFP和Myc，在蛋白水平證實了轉(zhuǎn)基因的表達。通過TG6和GFP（或Myc）免疫雙重染色，在細胞水平顯示轉(zhuǎn)基因TG6確實表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)。轉(zhuǎn)基因小鼠的成