FAAP基因敲除小鼠模型的構(gòu)建和表型初步分析.pdf

1、粘著斑相關(guān)蛋白（FAAP，focal adhesion associated protein）是由小鼠D10Wsu52e基因編碼的分子量為55kD的蛋白，進(jìn)化上非常保守，在細(xì)菌、古生菌和后生動(dòng)物中廣泛分布。在小鼠不同組織中的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AAP在生殖器官中高表達(dá)，推測(cè)其是一個(gè)與生殖系統(tǒng)緊密相關(guān)的基因。為探索FAAP在雄性生殖系統(tǒng)中的功能，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄PCR及Western Blot研究了FAAP在雄性生殖系統(tǒng)中的表達(dá)模式。結(jié)果顯示

2、，F(xiàn)AAP mRNA在睪丸、附睪、輸精管、前列腺中都檢測(cè)有表達(dá)，在精囊中未檢測(cè)到其表達(dá)，而睪丸和附睪中FAAP的表達(dá)量高。Western Blot檢測(cè)C57BL/6J雄性小鼠出生后第1、7、14、21、28、35、42天附睪及睪丸中FAAP蛋白表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AAP蛋白的表達(dá)量隨出生后天數(shù)而逐漸增加。這表明FAAP可能在小鼠附睪形態(tài)發(fā)育、功能維持和精子成熟中起作用。實(shí)驗(yàn)可以作為 FAAP基因敲除小鼠的野生型對(duì)照組來(lái)觀察敲除組和野生型不同發(fā)

3、育時(shí)期附睪和睪丸中FAAP的表達(dá)變化，進(jìn)而為觀察不同發(fā)育時(shí)期小鼠的附睪形態(tài)、精子形態(tài)和受精能力做鋪墊。
　　利用基因打靶技術(shù)構(gòu)建FAAP基因敲除小鼠模型：KO（knockout)-First基因敲除小鼠模型。KO-First是一種多用途的模型，與條件敲除策略類似，在靶片段的兩側(cè)分別放置方向相同的loxP位點(diǎn)，同時(shí)還在靶片段5’端內(nèi)含子中放置一個(gè)兩側(cè)帶有FRT位點(diǎn)的SA-IRES-reporter片段。這樣的模型可以用靶基因的啟動(dòng)子

4、表達(dá)報(bào)告基因（reporter），通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)即可了解靶基因的表達(dá)情況；與表達(dá)Flp的工具鼠交配可去除 SA-IRES-reporter片段，得到常規(guī)的flox小鼠。KO First模型的flox小鼠與conditional KO模型的flox小鼠不同，conditional KO中的flox小鼠表型正常，但KO First卻是KO表型。所以通過(guò)檢測(cè) KO-First小鼠表型分析可以初步檢測(cè)FAAP KO表型。本實(shí)驗(yàn)所用的KO

5、-First小鼠是插入了FRT-lacZneo-FRT-loxP元件及 loxP位點(diǎn)的基因敲除小鼠，帶有LacZ報(bào)告基因，可用LacZ染色定位檢測(cè)報(bào)告基因了解FAAP的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在KO-First小鼠的大腦和睪丸附睪中FAAP的表達(dá)量高。通過(guò)KO-First小鼠與C57BL/6J小鼠檢測(cè)繁殖力發(fā)現(xiàn)，與C57BL/6J雄鼠相比，KO-First小鼠受孕率明顯降低。KO-First小鼠后代從出生后14天左右開(kāi)始出現(xiàn)死亡,在出生后第

6、28天至42天存活率低，很少有活過(guò)2個(gè)月的。表明 FAAP在小鼠生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起了重要作用。FAAP KO First小鼠可與 Flper小鼠交配后去除FRT-lacZneo-FRT元件，得到常規(guī)的FAAP flox小鼠。FAAP flox小鼠與Defb41iCre/wtCre小鼠交配即可獲得在附睪特異性敲除FAAP的條件敲除小鼠。
　　本實(shí)驗(yàn)利用KO-First基因敲除小鼠模型，可以進(jìn)行FAAP基因敲除小鼠初步的表型分析，為定向