cPLA2α基因敲除小鼠的構(gòu)建、繁殖與鑒定.pdf

1、目的：cPLA2α能夠高選擇性地水解膜磷脂，起始花生四烯酸和溶血磷脂級聯(lián)反應(yīng)，釋放一系列炎癥因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，cPLA2α在乳腺癌和肝癌患者組織中高表達(dá)，并且cPLA2α在乳腺癌細(xì)胞運動侵襲，肝癌細(xì)胞運動及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中具有重要作用。為了系統(tǒng)性地研究cPLA2α在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，利用先進(jìn)的TALEN技術(shù)構(gòu)建了cPLA2α基因敲除小鼠模型，繁殖得到基因敲除純合子，并對其進(jìn)行一系列的鑒定，最后通過體內(nèi)實驗證實

2、cPLA2α在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的作用。
　　方法：
　　1.分析cPLA2α基因序列，設(shè)計TALEN打靶載體，利用PCR與Golden Gate法組裝TALEN載體；
　　2.將TALEN載體體外轉(zhuǎn)錄的mRNA注射入小鼠受精卵中，經(jīng)母鼠代孕及與野生型雜交后獲得TALEN敲除F0及F1代小鼠；
　　3.利用F1代基因敲除雜合子小鼠進(jìn)行大規(guī)模的飼養(yǎng)繁殖；
　　4.提取幼鼠腳趾DNA，經(jīng)PCR與測序后鑒定幼鼠基因

3、型，得到cPLA2α基因敲除純合子小鼠；
　　5.提取基因敲除純合子、雜合子及野生型小鼠組織蛋白，Western Blotting檢測cPLA2α蛋白表達(dá)水平，驗證基因敲除效果；
　　6.收集三種基因型小鼠的代謝物，進(jìn)行UPLC/Q-TOF-MS后分析代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，尋找組間差異較大的代謝物；
　　7.構(gòu)建小鼠Lewis肺癌模型，證實cPLA2α在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中的作用；DEN誘導(dǎo)小鼠肝癌模型，研究cPLA2α在肝癌發(fā)生

4、中的作用。
　　結(jié)果：
　　1.選取cPLA2α基因中的外顯子3作為TALEN靶標(biāo)，成功構(gòu)建了TALEN-L和TALEN-R載體；
　　2.顯微注射后得到3只陽性F0代小鼠，與野生型雜交后得到共7只F1代雜合子小鼠，分別缺失三種片段；
　　3.利用4只F1代雜合子，經(jīng)過8個月的飼養(yǎng)繁殖，總計生產(chǎn)34次，獲得226只幼鼠；
　　4.對每只小鼠標(biāo)記及鑒定后，共得到cPLA2α基因敲除純合子小鼠36只；
　

5、　5. cPLA2α敲除純合子小鼠組織中，cPLA2α蛋白不表達(dá)，cPLA2α敲除雜合子小鼠cPLA2α蛋白表達(dá)水平比野生型低；
　　6.代謝組學(xué)結(jié)果顯示，花生四烯酸、溶血磷脂酸、前列腺素、白三烯、血栓素等代謝物在組間差異較大，可以將野生組與雜合組、純合組的樣本進(jìn)行很好的區(qū)分；
　　7. Lewis肺癌模型證實，cPLA2α敲除對腫瘤的生長無明顯影響，但幾乎完全抑制了腫瘤的肝轉(zhuǎn)移；DEN在野生型和cPLA2α敲除小鼠中均成功

6、誘導(dǎo)了肝癌。
　　結(jié)論：
　　1.利用TALEN技術(shù)成功構(gòu)建了cPLA2α基因敲除小鼠，得到F1代基因敲除雜合子；
　　2.繁殖得到了cPLA2α基因敲除純合子小鼠，為后續(xù)研究cPLA2α與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系提供了重要的動物模型；
　　3.從基因水平和蛋白水平兩個方面對基因敲除純合子小鼠進(jìn)行了鑒定與驗證；
　　4.代謝組學(xué)分析了cPLA2α基因敲除所引起的代謝物改變，間接證實了基因敲除模型構(gòu)建的成功，也為更