Neuritin轉基因小鼠的構建與鑒定.pdf

1、目的：本研究通過鑒定大鼠neurtin基因的轉錄本，利用顯微注射的方法獲得過表達大鼠neuritin基因的轉基因小鼠模型，為從系統(tǒng)生物學水平研究neuritin基因的功能奠定實驗基礎。
　　方法：1）利用比較基因組學分別設計與小鼠2個轉錄本同源的引物，采用RT-PCR的方法釣取大鼠neuritin基因。采用生物信息的方法對大鼠neuritin的序列同源性及蛋白結構進行全方位預測分析；2）構建由CMV超強啟動子驅動大鼠neuriti

2、n基因表達的真核表達載體-pcDNA3.1(+)-neuritin,RT-PCR擴增大鼠neuritin基因的編碼區(qū)，并在兩端引入 Xho-Ⅰ和 Nhe-Ⅰ酶切位點，對擴增產物和表達載體雙酶切后連接，然后轉化DH5α大腸桿菌,經菌落PCR、質粒的雙酶切及測序篩選出重組的pcDNA3.1(+)-neuritin陽性質粒；3）用受精卵雄原核顯微注射法制備 neuritin轉基因小鼠:將pcDNA3.1(+)-neuritin質粒用BglⅡ和

3、StuⅠ限制性內切酶消化，回收純化約為2.3kb帶有Neurtin基因的片段。將純化后的片段顯微注射受精卵，經短暫體外培養(yǎng)，篩檢存活的胚胎，移植入假孕受體小鼠輸卵管,常規(guī)飼育。通過 PCR方法檢測出生小鼠基因組neuritin基因的插入和鼠尾組織中大鼠neuritin基因的表達。
　　結果：1）大鼠只存在一個neuritin轉錄本，編碼142個氨基酸，與其他動物的編碼序列高度同源；三級蛋白結構預測分析結果顯示大鼠Neuritin蛋

4、白富含α螺旋，其結構和理化性質無異于人類Neuritin蛋白；2）成功地構建了pcDNA3.1(+)–neuritin真核表達載體，經雙酶切、測序后證實neuritin基因插入載體的多克隆位點Xho-Ⅰ和Nhe-Ⅰ酶切位點間；3）用原核顯微注射711枚受精卵,經短暫體外培養(yǎng)存活275枚,存活率為38.67％,移植到30只受體鼠輸卵管中，受體鼠懷孕26只，共生產45只后代鼠（F0）。經PCR檢測,初步證實其中3只為neuritin陽性整合