fat-1基因?qū)T-29細(xì)胞增殖的抑制作用以及轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、目的:探討fat-1基因在結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的凋亡、增殖以及細(xì)胞周期中所起的作用，并對其抗腫瘤作用的機制進(jìn)行初步探討。構(gòu)建和鑒定攜帶有外源fat-1基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。 方法:構(gòu)建真核表達(dá)載體(pEGFP-fat-1)，用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染到結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞，通過熒光顯微鏡下觀察及RT-PCR的方法檢測fat-1基因的表達(dá)，氣相色譜分析的方法檢測fat-1，基因?qū)T-29細(xì)胞n-6/n-3 PUFAs比例的影響，MTT法

2、分析fat-1基因?qū)T-29細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測fat-1基因?qū)T-29細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期的影響，RT-PCR法檢測iNOS和COX-2的表達(dá)變化。 構(gòu)建pEF-fat-1重組質(zhì)粒，以顯微注射法把線性化重組質(zhì)粒注射到小鼠受精卵的雄原核，并將受精卵移植到受體鼠的輸卵管中產(chǎn)出轉(zhuǎn)基因小鼠，通過PCR、Soluthern blot雜交等方法確立陽性整合有目的基因的G<,0>代小鼠。 結(jié)果:成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體p

3、EGFP-fat-1，fat-1基因能在HT-29細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)，并降低了n-6/n-3 PUFAs的比例，抑制HT-29細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，細(xì)胞增殖主要被阻滯在S期，iNOS及COX-2的表達(dá)均降低。成功構(gòu)建了pEF-fat-1重組質(zhì)粒，顯微注射到小鼠受精卵，得到G0代小鼠，PCR、Southern blot雜交確立了4只整合有fat-1基因的首建鼠。 結(jié)論:fat-1基因能降低HT-29細(xì)胞n-6/n-3 PUFAs的比