fat-1基因對HT-29細胞增殖的抑制作用以及轉基因小鼠的構建與鑒定.pdf

1、目的:探討fat-1基因在結腸癌HT-29細胞的凋亡、增殖以及細胞周期中所起的作用，并對其抗腫瘤作用的機制進行初步探討。構建和鑒定攜帶有外源fat-1基因的轉基因小鼠。 方法:構建真核表達載體(pEGFP-fat-1)，用脂質體介導的方法轉染到結腸癌HT-29細胞，通過熒光顯微鏡下觀察及RT-PCR的方法檢測fat-1基因的表達，氣相色譜分析的方法檢測fat-1，基因對HT-29細胞n-6/n-3 PUFAs比例的影響，MTT法

2、分析fat-1基因對HT-29細胞增殖的影響，流式細胞術檢測fat-1基因對HT-29細胞的凋亡和細胞周期的影響，RT-PCR法檢測iNOS和COX-2的表達變化。 構建pEF-fat-1重組質粒，以顯微注射法把線性化重組質粒注射到小鼠受精卵的雄原核，并將受精卵移植到受體鼠的輸卵管中產(chǎn)出轉基因小鼠，通過PCR、Soluthern blot雜交等方法確立陽性整合有目的基因的G<,0>代小鼠。 結果:成功構建了真核表達載體p

3、EGFP-fat-1，fat-1基因能在HT-29細胞內(nèi)有效表達，并降低了n-6/n-3 PUFAs的比例，抑制HT-29細胞的增殖，促進其凋亡，細胞增殖主要被阻滯在S期，iNOS及COX-2的表達均降低。成功構建了pEF-fat-1重組質粒，顯微注射到小鼠受精卵，得到G0代小鼠，PCR、Southern blot雜交確立了4只整合有fat-1基因的首建鼠。 結論:fat-1基因能降低HT-29細胞n-6/n-3 PUFAs的比