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文檔簡介
1、目的:探討fat-1基因在結腸癌HT-29細胞的凋亡、增殖以及細胞周期中所起的作用,并對其抗腫瘤作用的機制進行初步探討。構建和鑒定攜帶有外源fat-1基因的轉基因小鼠。 方法:構建真核表達載體(pEGFP-fat-1),用脂質體介導的方法轉染到結腸癌HT-29細胞,通過熒光顯微鏡下觀察及RT-PCR的方法檢測fat-1基因的表達,氣相色譜分析的方法檢測fat-1,基因對HT-29細胞n-6/n-3 PUFAs比例的影響,MTT法
2、分析fat-1基因對HT-29細胞增殖的影響,流式細胞術檢測fat-1基因對HT-29細胞的凋亡和細胞周期的影響,RT-PCR法檢測iNOS和COX-2的表達變化。 構建pEF-fat-1重組質粒,以顯微注射法把線性化重組質粒注射到小鼠受精卵的雄原核,并將受精卵移植到受體鼠的輸卵管中產(chǎn)出轉基因小鼠,通過PCR、Soluthern blot雜交等方法確立陽性整合有目的基因的G<,0>代小鼠。 結果:成功構建了真核表達載體p
3、EGFP-fat-1,fat-1基因能在HT-29細胞內(nèi)有效表達,并降低了n-6/n-3 PUFAs的比例,抑制HT-29細胞的增殖,促進其凋亡,細胞增殖主要被阻滯在S期,iNOS及COX-2的表達均降低。成功構建了pEF-fat-1重組質粒,顯微注射到小鼠受精卵,得到G0代小鼠,PCR、Southern blot雜交確立了4只整合有fat-1基因的首建鼠。 結論:fat-1基因能降低HT-29細胞n-6/n-3 PUFAs的比
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