下調(diào)ALKBH2基因?qū)δI癌細(xì)胞株ACHN增殖的抑制作用研究.pdf

1、腎細(xì)胞癌是發(fā)生于腎臟實(shí)質(zhì)腎小管的人類常見(jiàn)腫瘤。此類腫瘤在人癌癥中占約為3％至2%。此類腫瘤的發(fā)病率僅位居膀胱腫瘤之后,在中國(guó)的發(fā)病率逐年上升，死亡率也逐年上升；原發(fā)性腎癌起病隱匿，發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已失去手術(shù)時(shí)機(jī)，盡管采取積極手術(shù)減瘤治療，及免疫治療，但療效欠佳。對(duì)中晚期腎癌，近期應(yīng)用舒尼替尼等生物學(xué)治療，雖可延長(zhǎng)生存期，但大多數(shù)病人仍難免死于腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。因此，進(jìn)一步探討腎癌的發(fā)展和惡性特征的腎細(xì)胞癌與基因的功能變化之間的關(guān)系，可幫助揭示其

2、分子機(jī)制，藥物的合理設(shè)計(jì)和預(yù)判RCC的發(fā)生和發(fā)展，對(duì)RCC的醫(yī)治尤其關(guān)鍵。
　　表觀遺傳學(xué)，例如組蛋白修飾以及DNA烷基化等對(duì)于腫瘤的研究具有指導(dǎo)作用。運(yùn)用表觀遺傳學(xué)的原理，可調(diào)控特異性的基因變化，為診療腎腫瘤提供了可能。表觀遺傳學(xué)在癌細(xì)胞有非常復(fù)雜的內(nèi)涵，DNA烷基化是人類癌細(xì)胞中最常見(jiàn)的遺傳改變，經(jīng)過(guò)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)觸媒反應(yīng)，DNA的兩個(gè)核苷酸C、G胞嘧啶可烷基化為5

3、-甲基胞嘧啶。DNA烷甲基化的H3K9以及H4K20等與轉(zhuǎn)錄下調(diào)有相關(guān)性。DNA烷基化與癌癥多階段的發(fā)病相關(guān)，也與慢性感染或炎癥相關(guān)。RCC具有大量的烷基化基因。Arai等報(bào)道，甲基化程度越低的患者腎腫瘤分期越早。Arai等對(duì)BAC-array的甲基化的研究結(jié)果進(jìn)一步提示了DNA甲基化與腫瘤發(fā)生的相關(guān)性。組蛋白修飾也介入了腎多種細(xì)胞癌的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。因組蛋白的烷基化靶點(diǎn)不一致,對(duì)遺傳物質(zhì)起激活或下調(diào)作用。組蛋白磷酸化和DNA損傷修復(fù)及轉(zhuǎn)錄

4、調(diào)節(jié)等有關(guān)。
　　ALKBH蛋白質(zhì)家族高表達(dá)于各種人類癌癥，涉及到腫瘤的生長(zhǎng)及發(fā)展。人類AlkB存在多個(gè)ALKBH基因的亞型，其個(gè)別異構(gòu)體和泌尿系統(tǒng)腫瘤的發(fā)展之間的關(guān)系是未知的，特別是涉及到腫瘤從非侵入性轉(zhuǎn)化為侵入性的進(jìn)展的分子機(jī)制，有待深入研究。ALKBH2為其中的一個(gè)亞型，在膀胱腫瘤中與癌蛋白-粘蛋白1（MUC1）分子有關(guān)，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，其基因水平上調(diào)可導(dǎo)致膀胱尿路上皮癌,在泌尿系腫瘤中具有重要的地位。

5、　　ALKBH2基因是大腸桿菌AlkB基因的同源物，現(xiàn)在被稱為雙脫氧酶的蛋白的作用下，可以在1-甲基腺嘌呤和3-甲基胞嘧啶甲基化時(shí)催化氧化，去除烷基，從而使得損傷的DNA修復(fù)。其在腦腫瘤及膀胱腫瘤中有高表達(dá)的報(bào)道。有研究表明：在某些胃癌中，ALKBH2是可能通過(guò)抑制胃癌細(xì)胞的增殖，參與了胃癌的分子機(jī)制。共同采取cDDP及調(diào)低ALKBH2的表達(dá)可提高非小細(xì)胞性肺癌的預(yù)后。研究該基-2-因產(chǎn)物在腎腫瘤中的作用，包括腎腫瘤的生存、凋亡、對(duì)細(xì)胞

6、周期的影響、對(duì)腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移方面的作用，具有一定的臨床意義。也可以研究是否可作為一種腫瘤標(biāo)志物用于臨床檢查和醫(yī)治。
　　目的：
　　為了研究ALKB2蛋白在腎癌中的作用，選取代表性的人腎癌（renal cell carcinoma RCC）細(xì)胞株ACHN和人正常腎小管上皮細(xì)胞HKC，檢測(cè)ALKB2的表達(dá)水平，以期發(fā)現(xiàn)表達(dá)差異。發(fā)現(xiàn)表達(dá)差異后，利用RNAi技術(shù)設(shè)計(jì)并篩選出ALKBH2基因敲減效果最優(yōu)的shRNA序列。構(gòu)建人源A

7、LKBH2基因shRNA干擾慢病毒表達(dá)載體進(jìn)行鑒定并利用慢病毒來(lái)作為shRNA序列的高效載體，侵染人腎癌細(xì)胞株ACHN，構(gòu)建ALKBH2基因敲減細(xì)胞模型。利用前期構(gòu)建好的ALKBH2基因敲減慢病毒，構(gòu)建體外細(xì)胞模型。探索ALKBH2基因被敲減后，ACHN在細(xì)胞增殖和凋亡等方面的功能變化以觀察其功能。
　　方法：
　　培養(yǎng)ACHN和HKC之后利用Western blot和qRT-PCR技術(shù)，分別從蛋白水平和基因水平檢測(cè)α-酮戊

8、二酸依賴的雙加氧酶AlkB同源體2(ALKB2)的表達(dá)。使用EGFP慢病毒侵染人腎癌細(xì)胞株ACHN，驗(yàn)證慢病毒侵染效率。構(gòu)建ALKBH2基因的高表達(dá)載體(pcDNA3.1-ALKBH2)分別與三個(gè)ALKBH2基因的shRNA載體共轉(zhuǎn)HEK293細(xì)胞。使用qRT-PCR技術(shù)測(cè)定篩選出干擾效果最優(yōu)的shRNA載體(shRNA-571)。使用最佳的shRNA序列的慢病毒載體的構(gòu)建，并包裝了慢病毒。使用包裝出來(lái)的慢病毒以適當(dāng)?shù)腗OI侵染人腎癌細(xì)

9、胞株ACHN，使用qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證慢病毒的干擾效果。抑制人的腎癌ACHN細(xì)胞以ALKBH2慢病毒感染，分別使用細(xì)胞毒性/增殖測(cè)定試劑盒CCK-8和Annexin V-PE/7-AAD試劑盒檢測(cè)人腎癌細(xì)胞株ACHN的細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果：
　　根據(jù)實(shí)測(cè)qRT-PCR的數(shù)據(jù)，按兩組樣本的平均△Ct值計(jì)算，ACHN組及HKC組的ALKBH2基因的相對(duì)表達(dá)量分別為8.73X10-3及6.55X10-4，ACHN細(xì)胞中

10、ALKBH2基因的表達(dá)水平約為人正常腎小管上皮細(xì)胞HKC中的13倍。以每個(gè)樣本的2-△Ct值為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算，差別在兩組之間的表現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01）。Western blot的數(shù)據(jù)也很好地印證了此結(jié)果。ACHN中ALKB2蛋白的相對(duì)表達(dá)量也大大高于HKC。EGFP慢病毒侵染ACHN細(xì)胞的MOI值測(cè)定結(jié)果顯示，MOI=10時(shí)，綜合分析ACHN細(xì)胞陽(yáng)性比例(熒光率）較高、細(xì)胞狀態(tài)較好。shRNA對(duì)目的基因ALKBH2的干擾效率為：ShR

11、NA-571(84.7%）> ShRNA-662(84.6%）>ShRNA-468(63.1%），選擇對(duì)ALKBH2干擾效果最佳的ALKBH2-571構(gòu)建慢病毒載體及包裝慢病毒，PL/shRNA/F-ALKBH2-571轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)48小時(shí)后，熒光顯微鏡下顯色效果滿意。病毒的滴度為1.1*108TU/ml。成功獲得ALKBH2基因敲減的ACHN細(xì)胞。qRT-PCR數(shù)據(jù)顯示ALKBH2基因敲減效率達(dá)到92.2%。人腎癌細(xì)胞株ACHN的ALKB

12、H2基因被敲減后，CCK-8細(xì)胞增殖-毒性實(shí)驗(yàn)顯示ALKBH2-干擾組的吸光度值為0.4033，陰性對(duì)照組的吸光度值為0.8427，兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01）。流式細(xì)胞測(cè)試結(jié)果顯示，ACHN細(xì)胞株經(jīng)shRNA-ALKBH2-571慢病毒侵染后，細(xì)胞晚期凋亡為26.457%，正常細(xì)胞為64.473%。兩者在細(xì)胞晚期凋亡有差異(P<0.05）。數(shù)據(jù)顯示人腎癌細(xì)胞株ACHN的ALKBH2基因被敲減后，表現(xiàn)出了明顯的細(xì)胞增殖受抑制