丹皮酚增強阿霉素對HepG2細(xì)胞株的增殖抑制作用及其機制研究.pdf

1、肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率為30.3/10萬，占所有癌癥的13.13％，居第3位，近二十年來，死亡率增加了41.7％，約占全世界HCC死亡人數(shù)的42％。近年來，由于丙型肝炎病毒感染增加，肝癌的發(fā)病率在發(fā)達(dá)國家也有上升的趨勢。目前，手術(shù)切除仍是治療HCC的最佳手段。但是80％的患者在診斷時已屬晚期，失去手術(shù)機會，而對于那些手術(shù)患者，其兩年內(nèi)的復(fù)發(fā)率也高達(dá)50％

2、?；熓悄[瘤治療的重要手段，但對肝癌的療效尚令人失望。作為肝癌治療最常用的藥物-阿霉素(Doxorubicin,Dox)其有效率也僅為4％-10.5％，并且其毒副反應(yīng)又進一步限制了其臨床應(yīng)用。傳統(tǒng)中藥以其高效、低毒的特點，近年來在腫瘤的防治中已引起了廣泛的重視。丹皮酚(Paeonol，Pae)又稱牡丹酚，是我省道地中藥材毛莨科植物牡丹PaeoniaSuffruicosa Andr.根皮和蘿摩科植物徐長卿Pycnostelma Panic

3、ulatum(Bunge)K.Schurn干燥根或全草的主要有效成分，具有鎮(zhèn)靜催眠、解熱鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)及保護心腦血管等廣泛的藥理活性。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，Pae對體外培養(yǎng)的多種腫瘤細(xì)胞的增殖有較強的抑制作用，體內(nèi)應(yīng)用有抗腫瘤作用。此外，我們也發(fā)現(xiàn)Pae能增強順鉑對人肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC-7721和人食管癌細(xì)胞Eca-109、SEG-1的增殖抑制作用。本研究選用肝癌HepG2細(xì)胞株作為實驗對象，觀察Pae聯(lián)合Dox對HepG2細(xì)

4、胞的增殖抑制作用，探討其可能的作用機制，以期為肝癌的臨床治療提供新的方法。 1.Pae聯(lián)合Dox對HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用采用MTT法，分別觀察了Pae和Dox單獨以及Pac聯(lián)合Dox對HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用。結(jié)果顯示：(1)Pae(7.81～250 mg/L)對HepG2細(xì)胞有增殖抑制作用，呈明顯的劑量和時間依賴性。以濃度的對數(shù)與抑制率進行直線相關(guān)分析：r=0.9612，P<0.01；IC50為64.30mg/L；(

5、2)系列濃度Dox(0.16~2.5mg/L)對HepG2細(xì)胞有增殖抑制作用，呈劑量依賴性。以濃度的對數(shù)與抑制率進行直線相關(guān)分析：r=0.9231，P<0.01；IC50為0.56 mg/L。(3)不同濃度的Pae(15.63、31.25、62.5mg/L)分別與系列濃度系列濃度Dox(0.16~2.5mg/L)聯(lián)合對HepG2細(xì)胞有增殖抑制作用。采用CD1分析兩藥相互作用性質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在合適的劑量下，Pae與Dox有協(xié)同作用(CDI

6、<1)。 2.Pae與Dox聯(lián)合對人肝癌細(xì)胞株HepG2凋亡影響 2.1 Pae與Dox聯(lián)合對人肝癌細(xì)胞株HepG2凋亡的TUNEL分析采用末端雙脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口標(biāo)記技術(shù)(terminaldeoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)觀察HepG2細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變。典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)特征包括核固縮、體積縮小、核染

7、色質(zhì)邊集等。研究發(fā)現(xiàn)對照組細(xì)胞增殖旺盛，可見少許凋亡細(xì)胞；藥物作用上述細(xì)胞48h后，細(xì)胞密度明顯減少，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加，以聯(lián)合用藥組最顯著。 2.2 Pae與Dox聯(lián)合對人肝癌細(xì)胞株HepG2凋亡的FCM檢測應(yīng)用流式細(xì)胞儀(Flow Cytometry.FCM)檢測細(xì)胞凋亡率。在DNA圖譜Go/G1期前出現(xiàn)了一個代表細(xì)胞凋亡的亞G1峰即凋亡峰。FCM結(jié)果顯示，正常對照組可見低矮的凋亡峰，藥物處理48h后，其凋亡峰增加，以聯(lián)合用

8、藥組最為顯著，提示兩藥合用有協(xié)同誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡作用。 2.3 Pae聯(lián)合Dox對人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞周期的影響用Mcycle軟件進行細(xì)胞周期分析。結(jié)果表明用藥組都不同程度的引起可引起HepG2細(xì)胞在S期大量堆積，G0/G1期細(xì)胞比例明顯下降以及G2/M期細(xì)胞比例的輕微減少。以聯(lián)合用藥組最為顯著，這表明Pae增強Dox對S期細(xì)胞的阻滯作用。 3.Pae聯(lián)合Dox誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的可能分子機制采用W

9、estern Blot檢測Bcl-2和Bax，采用細(xì)胞免疫組化法檢測COX-2Survivin和Caspase-3表達(dá)情況。結(jié)果表明，HepG2細(xì)胞中，Bcl-2、Bax、COX-2、Survivin和Caspase-3均有不同程度表達(dá)。藥物處理后HepG2細(xì)胞COX-2、Bcl-2和Survivin和表達(dá)降低，而Bax和Caspase-3表達(dá)增加，以聯(lián)合用藥組最為顯著。 4.結(jié)論 本結(jié)果表明一定濃度的Pae能增強Dox