重樓活性單體PP-26對肝癌HepG2細胞的增殖抑制作用及其機制.pdf

1、目的：
　　研究重樓活性單體PP-26對肝癌HepG2細胞的增殖抑制效應及其機制，為重樓活性單體PP-26的臨床抗腫瘤應用提供實驗室數(shù)據(jù)支持。
　　方法：
　　1.噻唑藍法（MTT法）檢測不同濃度的重樓活性單體PP-26對人肝癌HepG2、胰腺癌SW1990、前列腺癌LNCaP及人正常肝L02細胞的增殖抑制作用，以及采用IC20濃度的PP-26聯(lián)合不同濃度的氟尿嘧啶（5-FU）對肝癌HepG2細胞的藥物敏感性檢測；

2、r>　　2. Hoechst33258染色法檢測重樓活性單體PP-26對肝癌HepG2細胞凋亡的形態(tài)學的改變；Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測重樓活性單體PP-26對肝癌HepG2細胞凋亡的影響；
　　3.碘化丙錠（PI）單染流式細胞儀檢測重樓活性單體PP-26對肝癌HepG2細胞周期的影響；
　　4.蛋白免疫印跡法（Western blotting法）檢測重樓活性單體PP-26對肝癌HepG2細胞凋亡相關蛋白

3、、Bcl-2家族蛋白和細胞周期相關蛋白表達水平的影響，以及對Akt信號通路相關蛋白表達水平的影響。
　　結果：
　　1. MTT法檢測顯示，重樓活性單體PP-26能顯著抑制肝癌HepG2、胰腺癌SW1990及前列腺癌LNCaP細胞增殖，并呈劑量-效應關系，而對人正常肝L02細胞的毒性相對較小。不同濃度的PP-26作用于肝癌HepG2、胰腺癌SW1990及前列腺癌LNCaP細胞24 h的IC50分別為：6.94±0.72，2.

4、53±0.14，4.20±0.37μmol/L；不同濃度的PP-26作用于人正常肝L02、肝癌HepG2、胰腺癌SW1990及前列腺癌LNCaP細胞48 h的IC50分別為：6.98±0.99，1.91±0.45，1.90±0.07，2.45±0.11μmol/L；不同濃度的PP-26作用于人正常肝L02、肝癌HepG2、胰腺癌SW1990及前列腺癌LNCaP細胞72 h的IC50分別為：4.22±0.23，1.54±0.06，1.57

5、±0.09，2.01±0.07μmol/L，可見PP-26對人正常肝L02細胞的細胞毒作用低于癌細胞；以IC20濃度的PP-26聯(lián)合不同濃度的5-FU顯著增強對肝癌HepG2細胞的增殖抑制作用，提高HepG2細胞對5-FU的敏感性。
　　2. Hochest33258染色檢測顯示，3.2μmol/L及6.4μmol/L的重樓活性單體PP-26作用于HepG2細胞24 h后，熒光顯微鏡觀察細胞核出現(xiàn)固縮、邊聚、碎裂以及凋亡小體形成等

6、凋亡的形態(tài)學改變；Annexin V-FITC/PI雙染色流式細胞術檢測結果顯示。HepG2細胞總凋亡率隨著PP-26濃度的增加而增加，呈劑量-效應關系。
　　3.碘化丙啶（PI）單染流式細胞術檢測顯示，隨著作用于肝癌HepG2細胞的重樓活性單體PP-26濃度的增加，G2期細胞的比例逐漸增加，說明PP-26可以使肝癌HepG2細胞阻滯于G2期；同時Western blotting檢測結果顯示，細胞周期蛋白Cyclin D1、Cyc

7、lin B1及細胞周期依賴蛋白激酶-4（CDK4）表達水平隨著PP-26作用濃度的增加而下降，而Myt1、p21、p-cdc2（Tyr15）表達增高，說明細胞周期阻滯于G2期。
　　4. Western blotting結果顯示，在肝癌HepG2細胞中，凋亡相關蛋白caspase9、caspase3、PARP隨著PP-26濃度的增加表達下調，促凋亡蛋白Bax的表達上調，而抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1表達下調；同時

8、，隨著PP-26作用濃度的增加，磷酸化的Akt（p-Akt）的表達下調而總Akt表達變化不明顯，Akt下游的GSK3β和Foxo3磷酸化水平也下降，說明重樓活性單體PP-26通過抑制Akt信號通路激活細胞線粒體凋亡途徑而誘導HepG2細胞凋亡。
　　結論：
　　1.重樓活性單體PP-26可在體外顯著抑制肝癌HepG2、胰腺癌SW1990、前列腺癌LNCaP細胞增殖，而對正常人肝LO2細胞的增殖抑制作用不明顯，并能夠提高肝癌H