金雀異黃素對小鼠人肝癌HepG2細(xì)胞移植瘤的抑制作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:通過實(shí)驗(yàn)研究金雀異黃素(Genistein)對肝癌細(xì)胞增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,探討Genistein抗肝癌的作用機(jī)制,為肝癌治療提供新的方法及理論依據(jù)。
　　 方法:1體外實(shí)驗(yàn):體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞HepG2,采用四甲基偶氮唑藍(lán)(tetrzolium-based colorimetric assay,MTT)比色法測定不同濃度Genistein作用于該細(xì)胞24h、48h、72h后對其增殖抑制作用;2體內(nèi)實(shí)驗(yàn):

2、取健康雄性BALB/c小鼠(40只)稱重,將HepG2細(xì)胞接種于小鼠右側(cè)頸背部皮下,建立肝癌HepG2細(xì)胞小鼠模型。當(dāng)全部小鼠可以觸及到瘤體時(shí),記錄腫瘤體積。將小鼠按腫瘤體積編號,采用隨機(jī)數(shù)字法將小鼠隨機(jī)分為5組(每紺8只):陰性對照組;Genistein低劑量組;Genistein中劑量組;Genistein高劑量組;5-氟尿嘧啶組(5-Fu),荷瘤成功后第二天開始采用腹腔注射給藥方式給藥:陰性對照組給予生理鹽水(含二甲基亞砜DMSO

3、＜1％)0.2ml,每天給藥一次,連續(xù)14天;實(shí)驗(yàn)組分別給予不同劑量的Genistein(5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg),方法同陰性對照組;5-Fu組給予5-Fu0.2ml(16.5mg/ml),每周給藥一次,共兩次。在給藥期間觀察小鼠一般情況,記錄小鼠體重和腫瘤大小。所有小鼠在給藥后第15天頸椎脫臼處死,剝瘤、稱重,計(jì)算腫瘤體積和抑瘤率,應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期分布及凋亡率。普通光學(xué)顯微鏡及透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

4、;應(yīng)用免疫組化法檢測移植瘤組織Survivin、Caspase-3蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 Genistein抑制HepG2細(xì)胞增殖:MTT檢測結(jié)果顯示:不同濃度Genistein對HepG2細(xì)胞增殖均有抑制作用。Genistein(10、20、30、40、60、80、120μg/ml)作用于HepG2細(xì)胞24h、48h、72h后檢測,OD值均有不同程度下降,與陰性對照組相比,差

5、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。各處理組間比較差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),且伴隨藥物濃度的增加、作用時(shí)間的延長,抑制率逐漸升高,即表明Genistein對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用呈明顯時(shí)間-劑量依賴效應(yīng)。
　　 2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 2.1 Genistein明顯抑制小鼠腫瘤的生長:各組小鼠處死后腫瘤體積的比較,Genistein低、中、高劑量組的腫瘤體積隨著藥物濃度的增加而逐漸減小,腫瘤體積(mm3)分

6、別為:189.625±85.590、126.000±42.050、73.000±34.034,5-Fu組腫瘤體積(mm3)為52.000±31.0333,均明顯低于陰性對照組腫瘤體積(mm3)326.875±178.922,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),Genistein低、中、高劑量組與5-Fu組的瘤重明顯低于陰性對照組,差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01),Genistein低、中、高劑量組的抑瘤率隨著藥物濃度的增大而增加,分別

7、為:8.70％、26.10％、40.15％。而5-Fu組的抑瘤率為55.40％,明顯高于Genistein各劑量組。
　　 2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示:Genistein低、中、高劑量組G2/M期細(xì)胞逐漸增多,G0/G1期細(xì)胞逐漸減少,該作用有劑量依賴性,與陰性對照組相比,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),提示Genistein可阻滯細(xì)胞周期于G2/M期。Genistein低、中、高劑量組的凋亡百分率隨著藥物劑量的增加而逐

8、漸升高,分別為:10.58±3.27％、19.63±1.29％、32.24±1.64％,5-Fu組凋亡百分率為46.81±3.67％,均明顯高于陰性對照組凋亡率2.09±0.69％,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 2.3光鏡下觀察肝癌移植瘤組織細(xì)胞形態(tài)變化結(jié)果顯示:陰性對照組腫瘤細(xì)胞分布密集,多成團(tuán)狀,細(xì)胞核增大,細(xì)胞質(zhì)相應(yīng)縮小,核分裂像多見。Genistein治療組腫瘤細(xì)胞呈條索狀排列或呈彌漫性分布,細(xì)胞大小不等,形

9、態(tài)不規(guī)則,瘤組織內(nèi)可見淋巴細(xì)胞浸潤及不同程度的壞死。
　　 2.4透射電鏡下觀察移植瘤組織超微結(jié)構(gòu)改變:Genistein處理后的細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度凋亡性改變:微絨毛減少,細(xì)胞體積變小,胞質(zhì)致密,胞質(zhì)中空泡化變性明顯,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有脫顆粒現(xiàn)象,核染色質(zhì)高度濃縮,線粒體聚集,電子密度明顯增高,邊集于核膜下,形成沿核膜新月體狀,呈凋亡細(xì)胞的特征性形態(tài)改變,有的出現(xiàn)核固縮、核碎裂。
　　 2.5免疫組化檢測結(jié)果顯示:Survivi

10、n主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì),部分表達(dá)于細(xì)胞核,Caspase-3表達(dá)于細(xì)胞質(zhì),可見棕黃色著色。按照HIS值法進(jìn)行免疫組化評分,Genistein低、中、高劑量組Survivin表達(dá)值(HIS值)隨著藥物劑量的增大而逐漸減小,Caspase-3表達(dá)值(HIS值)則隨Genistein劑量的增大而逐漸增加。對于Survivin和Caspase-3這兩種蛋白,各自比較其處理組和陰性對照組的HIS值,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　

11、結(jié)論:
　　 1 Genistein具有抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖的作用,并且具有時(shí)間-劑量依賴性。
　　 2 Genistein對小鼠人肝癌HepG2細(xì)胞移植瘤具有抑制生長作用,并呈劑量依賴性。
　　 3 Genistein可誘導(dǎo)小鼠人肝癌HepG2細(xì)胞移植瘤凋亡,阻滯細(xì)胞周期于G2/M期,該作用呈一定的劑量依賴性。
　　 4 Genistein可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與下調(diào)Survivin蛋白,