Lupeol對(duì)肝細(xì)胞肝癌的抑制作用及其機(jī)制研究.pdf

1、本文研究了Lupeol對(duì)肝細(xì)胞肝癌的抑制作用及其機(jī)制。本研究分為三個(gè)部分：
　　 第一章：lupeol誘導(dǎo)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞凋亡并抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)。
　　 目的：研究lupeol體內(nèi)外抗肝癌作用,從整體、細(xì)胞、分子水平探討其作用機(jī)制:研究其與rTrail聯(lián)合抗肝癌作用。
　　 方法：⑴采用MTT法研究luepol體外對(duì)HCC細(xì)胞系細(xì)胞增殖的抑制作用,采用人HCC細(xì)胞系SMMC7721細(xì)胞移植腫瘤裸鼠模型研究lupeo

2、l對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用；⑵采用倒置顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)從形態(tài)學(xué)水平和生化角度檢測(cè)lupool對(duì)HCC細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)和細(xì)胞周期的影響,采用western blot方法分析其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制；⑶采用倒置顯微鏡觀察和流式細(xì)胞術(shù)從形態(tài)學(xué)水平和生化角度檢測(cè)lupeol與rTrail聯(lián)合對(duì)HCC細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)和細(xì)胞周期的影響,確定其聯(lián)合作用是否為協(xié)同作用。
　　 結(jié)果：①體外抑瘤結(jié)果顯示,lupeol能顯著抑制人HCC細(xì)胞增殖,并且具有量效

3、關(guān)系,作用48h的IC50為40μmol／L,-50μmolA,；體內(nèi)模型抑瘤試驗(yàn)結(jié)果顯示,lupeol能顯著抑制人HCC細(xì)胞系SMMC7721細(xì)胞移植腫瘤的生長(zhǎng)；②形態(tài)學(xué)倒置顯微鏡觀察和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,lupeol能誘導(dǎo)HCC細(xì)胞凋亡,阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程；western blot結(jié)果顯示lupeol作用后使促凋亡蛋白caspase-3、cleaved-PARP活化上調(diào),誘導(dǎo)胞內(nèi)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；③形態(tài)學(xué)倒置顯微鏡觀察和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示

4、,lupeol與rTrail聯(lián)合能抑制HCC細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)HCC細(xì)胞凋亡,但其作用只具有累加性,不具有協(xié)同性。
　　 結(jié)論：lupeol在體外能誘導(dǎo)HCC細(xì)胞凋亡,并能抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)；但其與rTrail聯(lián)合,只是具有相加作用,不具有協(xié)同性。
　　 第二章：Lupeol與P13K抑制劑S14161具有協(xié)同抗肝癌作用。
　　 目的：研究提高lupeol抗肝癌治療效果的方法；從細(xì)胞、基因、蛋白水平探討低濃度lupeo

5、l促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用機(jī)制,通過聯(lián)合P13K信號(hào)通路抑制劑,來協(xié)同提高lupeol抗肝癌治療效果。
　　 方法：⑴對(duì)lupeol化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造,采用MTT方法比較lupeol及其化學(xué)結(jié)構(gòu)改造后衍生物對(duì)HCC細(xì)胞系細(xì)胞增殖的抑制作用；⑵采用MTT方法、流式細(xì)胞術(shù)方法對(duì)比lupeol及其衍生物H2在低濃度區(qū)間對(duì)HCC細(xì)胞增殖的抑制作用、對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用,并采用RT-PCR、western blot方法研究其分子機(jī)制；⑶采用MTT

6、方法檢測(cè)P13K抑制劑S14161對(duì)HCC細(xì)胞增殖的抑制作用,選擇合適濃度,聯(lián)合低濃度lupeol,采用MTT方法檢測(cè)聯(lián)合用藥對(duì)HCC細(xì)胞增殖的抑制作用,并采用western blot方法研究其分子機(jī)制；⑷采用SMMC7721細(xì)胞移植腫瘤裸鼠模型,研究lupeol聯(lián)合S14161對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。
　　 結(jié)果：①M(fèi)TT結(jié)果顯示,lupeol衍生物H1、T1、T2對(duì)HCC細(xì)胞增殖的抑制作用低于lupeol,lupeol對(duì)H

7、CC細(xì)胞作用的IC50為40μmol／L-50μmol／L,H1、T1、T2作用的IC50分別為大于120μmol／L、大約50μmol／L、70μmol／L-80μmol／L；而衍生物H2對(duì)HCC細(xì)胞增殖的抑制作用優(yōu)于lupeol,IC50小于30μmol／L；②流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR、western blot結(jié)果顯示,低濃度lupeol不能誘導(dǎo)HCC細(xì)胞凋亡,對(duì)胞內(nèi)促凋亡分子及P13K／Akt信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)水平作用微小,而

8、低濃度H2能誘導(dǎo)HCC細(xì)胞凋亡,使胞內(nèi)促凋亡分子表達(dá)上調(diào)及P13K／Akt信號(hào)通路關(guān)鍵分子表達(dá)下調(diào)；③MTT結(jié)果顯示,S14161對(duì)HCC細(xì)胞作用的IC50大約為4μmol／L,選取1μmol／L和3μmol／L兩個(gè)濃度,進(jìn)行與lupeol的聯(lián)合用藥試驗(yàn)；MTT結(jié)果顯示,lupeol與1μmol／L和3μmol／L S14161聯(lián)合,協(xié)同促進(jìn)了對(duì)HCC細(xì)胞增殖的抑制作用,低濃度區(qū)間更為明顯；④western blot結(jié)果顯示,lupeo

9、l20μmol／L聯(lián)合S141611μmol／L和3τmol／L,協(xié)同下調(diào)了HCC胞內(nèi)P13K／Akt信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)；⑤腫瘤移植裸鼠模型體內(nèi)聯(lián)合用藥結(jié)果顯示,lupeol與S14161協(xié)同抑制了體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。
　　 結(jié)論：低濃度lupeol促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)是由于激活了P13K／Akt通路。Lupeol和S14161單獨(dú)應(yīng)用對(duì)HCC細(xì)胞增殖均有抑制作用,低劑量聯(lián)合有協(xié)同作用,聯(lián)合用藥提高了抗肝癌活性且無毒副作用。因而lupeol聯(lián)合

10、P13K信號(hào)通路抑制劑可能是更安全有效的抗腫瘤候選藥物,值得進(jìn)一步研發(fā)。
　　 第三章：慢性乙型肝炎患者外周血CD4+T細(xì)胞中可檢測(cè)到IL-35的表達(dá)。
　　 目的：檢測(cè)慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血CD4+T細(xì)胞中是否有IL-35的表達(dá),為CHB發(fā)病機(jī)制的研究和臨床治療提供理論依據(jù)。
　　 方法：從CHB患者和健康人外周血中分離純化CD4+T細(xì)胞,抽提總RNA和總蛋白,通過RT-PCR和免疫共沉淀(IP)&w

11、estern blot方法,檢測(cè)IL-35 mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。
　　 結(jié)果：RT-PCR結(jié)果顯示,純化的CHB患者外周血CD4+T細(xì)胞中可檢測(cè)到IL-35 mRNA的表達(dá)；IP&western blot結(jié)果顯示,純化的CHB患者外周血CD4+T細(xì)胞中可檢測(cè)到IL-35蛋白的表達(dá)。而健康人檢測(cè)不到。
　　 結(jié)論：CHB患者外周血CD4+T細(xì)胞中IL-35的表達(dá)可能參與抑制機(jī)體抗HBV特異性免疫反應(yīng),更好的闡明了