Crizotinib對(duì)肺癌LLC細(xì)胞“主側(cè)群”的抑制作用及其機(jī)制.pdf

1、肺癌是一種發(fā)病率、死亡率極高的惡性腫瘤?；?008年GLOBOCAN統(tǒng)計(jì)，在男性患者中，肺癌的發(fā)病率居首。肺癌新發(fā)病例占新發(fā)癌癥總數(shù)的17％，其死亡患者占癌癥死亡總數(shù)的23％。同時(shí)發(fā)展中國(guó)家對(duì)于女性肺癌患者的負(fù)擔(dān)高達(dá)宮頸癌的負(fù)擔(dān)。隨著對(duì)干細(xì)胞和腫瘤生物學(xué)研究的深入，人們觀察到腫瘤中有一小群具有自我更新和再生腫瘤能力的細(xì)胞，被稱為腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell，CSC)。目前研究認(rèn)為CSC是引起臨床上化療失敗、腫瘤復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)

2、處轉(zhuǎn)移的主要原因。研究CSC首要步驟是分離“側(cè)群”(side population，SP)細(xì)胞。進(jìn)一步研究顯示SP細(xì)胞有自我更新、無(wú)限增殖能力及強(qiáng)致瘤性，具有腫瘤干細(xì)胞的特性。
　　近年分子靶向治療越來(lái)越受到人們的關(guān)注。Crizotinib(PF-02341066)是一種以ALK和c-Met為靶點(diǎn)的小分子口服藥。2011年8月，Crizotinib被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于臨床治療ALK陽(yáng)性的非小細(xì)胞肺癌。本研究通過(guò)研究Crizotin

3、ib對(duì)路易士肺癌(lewis lung cancer，LLC)細(xì)胞株“主側(cè)群”的治療作用，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　材料與方法：
　　1、分離及鑒定肺癌細(xì)胞系LLC“主側(cè)群”細(xì)胞
　　(1)利用Hoechst33342外排實(shí)驗(yàn)，分離肺癌細(xì)胞系LLC“主側(cè)群”細(xì)胞。
　　(2)利用RT-PCR，Western blot及IF(immunofluorescence)鑒定各細(xì)胞亞群中的ABCG2和CD133含量。<

4、br>　　(3)利用FISH(Fluorescence in situ hybridization)檢測(cè)各細(xì)胞亞群ALK基因變異情況。
　　2、Crizotinib對(duì)肺癌細(xì)胞系LLC“主側(cè)群”細(xì)胞表型的影響及其分子機(jī)理研究
　　(1)運(yùn)用藥敏試驗(yàn)測(cè)定Crizotinib對(duì)肺癌細(xì)胞系LLC“主側(cè)群”細(xì)胞的最適作用濃度(IC50)和時(shí)間。
　　(2) Crizotinib處理后，AnnexinⅤ-FITC/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞

5、凋亡，PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期，并利用分光光度法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Caspase-3、8、9活性。
　　3、Crizotinib對(duì)肺癌細(xì)胞系LLC“主側(cè)群”在裸鼠體內(nèi)成瘤的影響
　　(1)觀察各亞群的成瘤能力差異。
　　(2)經(jīng)Crizotinib治療后，定期測(cè)量腫瘤體積及重量。同時(shí)利用單抗CD31檢測(cè)血管密度。
　　4、Crizotinib對(duì)肺癌細(xì)胞系LLC“主側(cè)群”作用機(jī)制檢測(cè)。
　　(1)應(yīng)用SYBYL-Ⅹ1.3

6、等軟件模擬Crizotinib可能作用的蛋白活性中心，對(duì)可能的通路蛋白進(jìn)行初篩。
　　(2)實(shí)驗(yàn)證明Crizotinib誘導(dǎo)凋亡的可能機(jī)制。利用RNA芯片或Westernblot技術(shù)優(yōu)先檢測(cè)Smad3通路的變化。
　　結(jié)果：
　　1、利用Hoechst33342外排實(shí)驗(yàn)分離LLC“主側(cè)群”細(xì)胞并鑒定
　　利用流式細(xì)胞技術(shù)確定“側(cè)群”細(xì)胞在總體細(xì)胞中的比例為0.37％。利用RT-PCR和Western blot分別

7、對(duì)LLC“主側(cè)群”細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明“側(cè)群”細(xì)胞比“主群”細(xì)胞的CD133和ABCG2含量高。IF結(jié)果同樣顯示“側(cè)群”細(xì)胞比“主群”細(xì)胞CD133和ABCG2表達(dá)水平高。FISH結(jié)果顯示LLC“主側(cè)群”細(xì)胞均為ALK陰性細(xì)胞。
　　2、Crizotinib對(duì)肺癌細(xì)胞系LLC“主側(cè)群”細(xì)胞表型的影響
　　克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，處理后“主群”細(xì)胞增殖受到抑制，并呈濃度依賴性。Crizotinib對(duì)“主群”細(xì)胞的IC50值為2

8、1.3 nM。Crizotinib和Verapamil(500μM)聯(lián)合用藥抑制“側(cè)群”細(xì)胞增殖，IC50值為22.4 nM。分別利用“主側(cè)群”細(xì)胞IC50值濃度的Crizotinib對(duì)其細(xì)胞進(jìn)行作用，確定Crizotinib“主側(cè)群”細(xì)胞的最佳作用時(shí)間為24 h。最適作用濃度和時(shí)間用于后續(xù)試驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn)處理后“主群”細(xì)胞凋亡增強(qiáng)和G1期阻滯，并且伴隨Caspase-3、8、9活性增高?！皞?cè)群”細(xì)胞未見(jiàn)明顯影響。Crizotinib和V

9、erapamil聯(lián)合用藥，結(jié)果顯示“側(cè)群”細(xì)胞出現(xiàn)凋亡和G1期阻滯，同時(shí)Caspase-3、8、9活性增高。
　　3、觀察Crizotinib對(duì)肺癌細(xì)胞系LLC“主側(cè)群”裸鼠荷瘤模型的影響
　　Crizotinib可以有效抑制LLC“主群”細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)，Crizotinib和Verapamil聯(lián)合用藥可以有效抑制LLC“側(cè)群”細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)。免疫組化結(jié)果顯示經(jīng)治療的裸鼠瘤內(nèi)血管密度明顯低于對(duì)照組。

10、>　　4、Crizotinib對(duì)肺癌細(xì)胞系LLC“主側(cè)群”作用機(jī)制檢測(cè)
　　SYBYL-Ⅹ1.3軟件模擬結(jié)果提示Crizotinib能夠與Smad3蛋白的活性中心結(jié)合。Western blot結(jié)果顯示經(jīng)Crizotinib處理后Smad2和3總量沒(méi)有變化，而P-Smad2和3明顯增高，進(jìn)而誘導(dǎo)Smad4含量增高。RNA芯片結(jié)果顯示Smad2和3RNA含量沒(méi)有明顯變化。
　　結(jié)論：
　　1、LLC“主側(cè)群”細(xì)胞在致癌性和