siRNA靶向沉默hTERT對肺癌細(xì)胞增殖的抑制作用.pdf

1、目的：
　　 (1)檢測不同病理類型肺癌細(xì)胞株中hTERT mRNA表達(dá)情況，探討hTERTmRNA隨著原代細(xì)胞傳代的變化并篩選出表達(dá)量較高的肺癌細(xì)胞系進(jìn)行后期實(shí)驗(yàn)。
　　 (2)設(shè)計(jì)并化學(xué)合成3對靶向hTERTmRNA的siRNA序列并轉(zhuǎn)染入95D細(xì)胞中，探討hTERTmRNA-siRNA對hTERT基因的沉默和肺癌細(xì)胞的增值抑制作用，并篩選出具有高效干擾效果的siRNA序列。
　　 (3)將hTERT mRN

2、A-siRNA重組入質(zhì)粒介載體中，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到肺癌H1299細(xì)胞，探討在肺巨細(xì)胞癌95D細(xì)胞株中篩選出的siRNA序列在肺腺癌H1299細(xì)胞是否具有干擾效應(yīng)，siRNA干擾作用是否在不同癌癥的病理類型存在差異。
　　 方法：
　　 (1)培養(yǎng)多種不同類型的肺癌細(xì)胞株及從肺癌病人組織中獲取的原代細(xì)胞株，用TRIZOL法提取細(xì)胞總RNA。然后運(yùn)用RealTime RT-PCR法檢測各細(xì)胞株中hTERTmRNA的表達(dá)，并對熒光

3、定量PCR后的擴(kuò)增產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳。
　　 (2)設(shè)計(jì)3對hTERT mRNA-siRNA分別轉(zhuǎn)染95D細(xì)胞，分別運(yùn)用Real Time RT-PCR技術(shù)、western blot技術(shù)、MTT、流式細(xì)胞儀等方法比較轉(zhuǎn)染前后及轉(zhuǎn)染不同siRNA序列細(xì)胞中hTERT mRNA表達(dá)、hTERT蛋白表達(dá)、細(xì)胞周期間差異。篩選出高效的siRNA序列。
　　 (3)構(gòu)建siRNA表達(dá)載體，通過脂質(zhì)體的方法將重組siRNA表達(dá)載體

4、及空白載體轉(zhuǎn)染到肺癌H1299細(xì)胞，G418篩選、單克隆之后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。分別運(yùn)用Real Time RT-PCR技術(shù)、western blot技術(shù)、MTT、流式細(xì)胞儀等方法比較重組siRNA表達(dá)載體及空白載體組細(xì)胞中hTERT mRNA表達(dá)、hTERT蛋白表達(dá)、細(xì)胞周期間差異。進(jìn)一步驗(yàn)證篩選出的siRNA的高效性。
　　 結(jié)果：
　　 (1)在肺癌細(xì)胞中，hTERT mRNA均有表達(dá)，其中肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞95D表達(dá)最

5、高;而對于肺癌原代細(xì)胞，隨著傳代次數(shù)的增加，hTERT mRNA表達(dá)逐漸下降。
　　 (2) hTERT siRNA轉(zhuǎn)染95D細(xì)胞48小時(shí)后（轉(zhuǎn)染濃度為100nmol/L），與空白脂質(zhì)體對照組和陰性對照組比較，siRNA-1和siRNA-2均明顯抑制了hTERT mRNA表達(dá)(P值均小于0.01)，抑制率分別為77.33±5.13％和50.67±8.02％，siRNA-3抑制率較低，僅為27.67±10.26％。
　　

6、(3)選取抑制效果最顯著的hTERTsiRNA-1對95D肺癌細(xì)胞進(jìn)行由低到高3個濃度的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染濃度分別為50nmol/L，80nmol/L，100nmol/L。50nmol/L濃度轉(zhuǎn)染組與陰性對照組之間hTERT mRNA表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。80nmol/L組、100nmol/L濃度轉(zhuǎn)染組分別與陰性對照組比較，hTERT mRNA表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均小于0.01），而這兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0

7、.05)。
　　 (4)轉(zhuǎn)染48h后，與空白脂質(zhì)體對照組比較，50nmol/L、80mol/L、100nmol/L濃度的hTERT siRNA-1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率均顯著增加（P值均小于0.01）。與陰性對照組比較，50nmol/L濃度轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率無顯著增加(P＞0.05)，而80nmol/L、100nmol/L組細(xì)胞凋亡率顯著增加（P值均小于0.01）。空白脂質(zhì)體對照組與陰性對照組比較亦有顯著差異(P＜0.05)。

8、　　 (5)MTT檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染12小時(shí)后肺癌細(xì)胞增殖抑制作用開始顯現(xiàn)，但效果尚弱，24小時(shí)已較明顯，48小時(shí)最顯著，72小時(shí)抑制效果轉(zhuǎn)弱。hTERT siRNA可以有效抑制肺癌細(xì)胞增殖，抑制效應(yīng)具有時(shí)間依賴性。
　　 (6)pGenesil.1-hTERT轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞經(jīng)單克隆后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株H1299-pGenesil.1-hTERT和H1299-pGenesil.1。與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒細(xì)胞組相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染si

9、RNA質(zhì)粒細(xì)胞的hTERT mRNA表達(dá)量顯著下降，抑制率為93.97±0.83％，P＜0.01。
　　 (7)肺癌H1299-pGenesil.1-hTERT細(xì)胞較H1299-pGenesil.1細(xì)胞hTERT蛋白的表達(dá)受到明顯抑制。
　　 (8)肺癌H1299-pGenesi1.1-hTERT細(xì)胞較H1299-pGenesil.1細(xì)胞增殖能力降低。
　　 (9)H1299-pGenesil.1-hTERT細(xì)胞

10、與對照組H1299-pGenesil.1比較，G1期細(xì)胞增多，比對照組增加了18.3％(P＜0.05)，S、G2期細(xì)胞分別少了10.4％、7.9％(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 (1) hTERT基因在不同類型肺癌細(xì)胞均有表達(dá);隨著原代肺癌細(xì)胞的傳代培養(yǎng)傳代增加，hTERT表達(dá)量逐漸下降。
　　 (2)人肺癌細(xì)胞系L78、NCI-H520、A549、LTEP-α-2、NCI-H460和95D中hTERTm

11、RNA均高表達(dá)，其中肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞95D相對表達(dá)量最高。
　　 (3)有效設(shè)計(jì)并合成了特異性針對hTERT的siRNA，可以有效下調(diào)肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞95D的端粒酶hTERT mRNA表達(dá)，從而抑制端粒酶活性、誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，抑制肺癌細(xì)胞增殖。
　　 (4)成功構(gòu)建的hTERT mRNA-siRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)肺癌H1299細(xì)胞后，可以有效下調(diào)細(xì)胞中hTERT mRNA、蛋白表達(dá)，抑制端粒酶活性和肺癌細(xì)胞的增殖，改變細(xì)胞