靶向糖基轉(zhuǎn)移酶shRNA表達質(zhì)粒對肝癌細胞增殖和遷移能力的抑制作用.pdf

1、一、研究背景
　　 糖蛋白廣泛存在于細胞膜和細胞間質(zhì)中,由寡糖和蛋白質(zhì)以共價方式連接而成。絕大多數(shù)寡糖是其相應的糖蛋白的功能中心,在細胞識別、信號傳遞中起關(guān)鍵作用。糖鏈的形式有多種,其中N-糖鏈的結(jié)構(gòu)改變足細胞惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟。多數(shù)研究證明在腫瘤細胞巾,常發(fā)現(xiàn)糖蛋白結(jié)構(gòu)的異常增加,出現(xiàn)了腫瘤組織“異常糖基化”。發(fā)生這種變化的具體機制尚不清楚,但在大多數(shù)情況下,糖基轉(zhuǎn)移酶的激活起著主要的作用。
　　 糖基轉(zhuǎn)移酶在糖蛋白的

2、合成中起關(guān)鍵作用。N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶分布于高爾基體,其主要功能是在核心五糖基礎(chǔ)上形成多分支結(jié)構(gòu),將供體底物UDP-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)中的GlcNAc(Gn)糖基轉(zhuǎn)移至N-聚糖五糖核心的兩個甘露糖。N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶至少有6種,其中N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶V(N-acetylglucosaminyltransferase V,GnT-V)是目前研究最多的。在正常體內(nèi),GnT-V是參與N-糖鏈生物合成的酶

3、類,是糖蛋白N-糖鏈加工酶之一,具有決定N-糖鏈類型及復雜型糖鏈結(jié)構(gòu)的重要作用。在高爾基體內(nèi)催化形成N-糖鏈的β1,6分支,將核糖體合成的蛋白進行糖基化修飾。
　　 N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶V(N-acetylglucosaminyltransferase V,GnT-V)除了具有糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性這一特征外,最近有研究表明N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶V是一個高爾基體酶,在某些腫瘤細胞中,可被分泌到培養(yǎng)基中,其分泌機制還不能確定。但

4、是被分泌出細胞的GnT-V在生理濃度范圍內(nèi)能引起腫瘤血管生成,而腫瘤血管生成是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。
　　 RNAi技術(shù)是指在生物體細胞中,外源性或內(nèi)源性的雙鏈RNA(double2stranded RNA,dsRNA)引起與其同源mRNA的特異性降解,而抑制其相應基因表達的過程。RNA干擾具有高效性,穩(wěn)定性,特異性等優(yōu)點,它選擇性地沉默腫瘤細胞內(nèi)的癌基因和抑癌基因,抑制其功能表達,分析其表型的改變,有利于揭示腫瘤發(fā)生與病變的分子機制

5、,從而為腫瘤的診斷和治療提供治療靶點。
　　 本課題旨在利用RNA干擾技術(shù),將靶向針對GnT-V的shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進肝癌細胞,用cck-8增殖實驗,劃痕實驗,趨化運動試驗以及體內(nèi)皮下成瘤實驗來觀察肝癌細胞增殖和遷移能力的改變,為肝癌分子靶向治療研究中新靶標的確定提供客觀依據(jù)。
　　 二、研究目的：
　　 將靶向針對高表達基因GnT-V的shRNA表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進人肝癌HepG2細胞,觀察GnT-V的表達變化對He

6、pG2細胞體外及體內(nèi)增殖和遷移能力的影響,為肝癌分子靶向治療研究中新靶標的確定提供客觀依據(jù)。
　　 三、實驗方法
　　 1、pGPU6/GFP/Neo GnT-VshRNA質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定已由本課題組成員賀富麗完成,方法如下:
　　 a.GnT-V siRNA序列的設計:按照siRNA設計原則,利用Ambion公司提供的“siRNA Target Finder and Design Tools”,根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)

7、庫中GnT-V基因(NM 002410.3)cDNA,設計針對GnT-VcDNA的RNA片段,序列分別如下:sense 5' GGAAGTGCATGCAACTGTTTA 3',sense 5' CTCCTTTGACCCTAAGAAT3'。分別命名為GnT-V/1564和GnT-V/2224。將其中一對的序列打亂排列,經(jīng)Blast比對,無任何同源性超過70％的序列,作為陰性對照干擾序列,序列如下:sense 5'GTTCTCCGAACGT

8、GTCACGT 3',命名為GnT-V/NC。
　　 b.shRNA轉(zhuǎn)錄模板DNA的設計:根據(jù)前面設計的siRNA序列,設計模板DNA鏈,其順序分別為Bbs I酶切位點、正義序列、9nt loop連接序列、反義序列、RNA聚合酶Ⅲ終止子(6個T)、BamH Ⅰ酶切位點。
　　 c.質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo GnT-V的構(gòu)建及鑒定:先將各組2條模板單鏈退火處理,再與雙酶切后的pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒連接,構(gòu)建成

9、重組體質(zhì)粒。將重組體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α,篩選卡那霉素抗性克隆,利用限制性內(nèi)切酶Bbs Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切及測序鑒定重組質(zhì)粒。大量擴增搖菌后,抽提質(zhì)粒純化。
　　 2、細胞培養(yǎng)
　　 人肝癌細胞株HepG2在37℃ 5％CO2條件下,培養(yǎng)于含10％新生牛血清的RPMI-1640中,每周傳代2～3次。HepG2細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期,用脂質(zhì)體Lipofectamine2000TM將質(zhì)粒導入HepG2細胞。用G418篩選

10、陽性細胞克隆。
　　 3、細胞轉(zhuǎn)染
　　 HepG2細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期,用脂質(zhì)體Lipofectamine2000TM將質(zhì)粒導入HepG2細胞。用G418篩選陽性細胞克隆。
　　 4、pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA干擾效果檢測
　　 a.RT-PCR測定GnT-V mRNA
　　 用Trizol提取對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細胞總RNA,采用AMV逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA.GnT-V上游

11、引物為5'AACTCTTGGACCATCCTGGGTTC 3',下游引物為5'TTGCTGCTTTTGGGTGGGTT 3'。β-actin作為內(nèi)參,上游引物為5'GAAACTACCTTCAACTCCATC 3 ' 下 游 引 物 為 5 'CGAGGCCAGGATGGAGCCGCC 3'。反應條件為:94℃預變性5min,94℃變性30s,58℃退火30s,72℃延伸30s,共36個循環(huán),最后72℃再延伸10min。GnT-V擴增產(chǎn)物

12、長度為555bp,β-actin長度為219bp。電泳后UVI凝膠成像系統(tǒng)攝像,Image-Pro Plus 6.0軟件分析條帶灰度值,用GnT-V/β-actin代表GnT-V的相對表達量。
　　 b.Western blot檢測GnT-V蛋白表達
　　 提取總蛋白,用測定蛋白濃度,吸取50μg總蛋白,去離子水補至20μL,加入等體積2×上樣buffer煮沸7min,離心后吸取30μL上樣,經(jīng)不連續(xù)SDS-PAGE電泳

13、分離后,用半干法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5％脫脂奶粉37℃封閉2h,TBST洗膜后用羊抗人GnT-V蛋白多克隆抗體(1:200)、鼠抗人GAPDH蛋白單克隆抗體(1:1000)4℃孵育過夜,洗膜后分別加入HRP標記的兔抗羊IgG(1:500)、HRP標記的羊抗鼠IgG(1:5000),室溫下?lián)u動1h,洗膜后用ECL化學發(fā)光系統(tǒng)檢測,暗室曝光X線片,沖洗膠片,UVI凝膠成像系統(tǒng)攝像,Image-Pro Plus 6.0軟件分析條帶灰度值,用

14、GnT-V/GAPDH代表GnT-V的相對表達量。
　　 5、CCK-8檢測pGPU6/GFP/Neo GriT-V shRNA干擾后對HepG2細胞增殖能力的影響
　　 取HepG2 GnT-V/1564和HepG2 GnT-V/NC對數(shù)生長期的待測細胞,CCK-8法分析不同時間點的細胞活力(0h、24h、48h、72h、96h),每個時間點分別檢測6個復孔。測量兩組的OD450nm值,繪制生長曲線,并計算HepG2

15、GnT-V/1564的生長抑制率。細胞生長抑制率(IR)=(對照組OD450值-干擾組OD450值)/對照組OD450值×100％。
　　 6、pGPU6/GFP/Neo GnT-VshRYA干擾后對HepG2細胞遷移能力的影響
　　 a.趨化運動實驗
　　 取HepG2 GnT-V/1564和HepG2 GnT-V/NC對數(shù)生長期的細胞,用無血清RPMI1640培養(yǎng)過夜。通過24孔趨化小室檢測細胞遷移性,趨化因

16、子為10％新生牛血清。計算穿過聚碳酸酯膜的細胞數(shù),顯微鏡下每個復孔隨機取5個高倍鏡視野計數(shù)(400×)。
　　 b.劃痕愈合實驗
　　 取HepG2 GnT-V/1564和HepG2 GnT-V/NC對數(shù)生長期的待測細胞,細胞接種于包被CollagenⅣ的6孔板,培養(yǎng)至細胞呈單層貼壁生長狀態(tài)。分別在各組單細胞層上劃痕,用含10％FBS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)以使劃痕愈合。分別于劃痕后0h、12h、24h、36 h每個孔取4個視野

17、拍照,觀察劃痕愈合能力,用愈合率代表愈合能力。愈合率=[(愈合前兩側(cè)細胞層距離-愈合后兩側(cè)細胞層距離)/愈合前兩側(cè)細胞層距離]×100％。
　　 7、裸鼠成痛實驗
　　 取HepG2 GnT-V/1564和HepG2 GnT-V/NC對數(shù)生長期的細胞,調(diào)整細胞濃度為2.5×107/mL,按100μL/只進行臀部皮下注射。左臀部:HepG2 GnT-V/NC組,右臀部:HepG2 GnT-V/1564組。
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18、、統(tǒng)計學分析
　　 實驗結(jié)果均經(jīng)SPSS13.0軟件統(tǒng)計。兩組比較采用t檢驗,多組比較采用方差分析,以P<0.05表示有統(tǒng)計學意義。
　　 四、結(jié)論
　　 1、pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA真核表達質(zhì)?？梢燥@著下調(diào)GnT-VmRNA和蛋白表達量。
　　 2、下調(diào)GnT-V的表達后,HepG2細胞的體外增殖和遷移能力受到抑制。
　　 3、下調(diào)GnT-V的表達后,HepG2細胞的體