葫蘆素B對肝癌細胞侵襲和轉移的抑制作用及其機制的研究.pdf

1、實驗目的：
　　 肝癌是世界上最常見的消化道惡性腫瘤。肝癌的致死率在癌癥引起的死亡中占第3位,肝癌的預后主要取決于是否有轉移和術后復發(fā)。因而抗肝癌的侵襲轉移,減少術后復發(fā)成為當今肝癌防治領域研究的熱點。
　　 惡性腫瘤的侵襲和轉移是一個多步驟、多環(huán)節(jié)的過程,包括粘附、遷移、細胞外基質或基底膜的降解等步驟?；|金屬蛋白酶(matrix metallo proteina ses,MMPs)因能水解細胞外基質,促進腫瘤的轉移而

2、引起人們的廣泛重視,其中MMP-9的過度表達與肝癌的侵襲轉移密切相關。MMP-9的表達可以被很多刺激因素誘導表達,這些刺激因素包括血管內皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)、腫瘤壞死因子(TNF-α)等。在這些刺激因素中,TPA廣泛被用來誘導MMP-9的表達。TPA是蛋白激酶C(PKC)的選擇性激活劑,PKC激活后,通過MAPK(ERK、JNK、p38)以及PI3K/Akt通路調節(jié)轉錄因子NK-κB和AP-1的活性,進而調節(jié)M

3、MP-9的基因表達。有多項研究證實,抑制MMP-9的活性,可以預防腫瘤的侵襲轉移。因此,尋找有效的藥物,抑制腫瘤的侵襲和轉移是目前抗腫瘤研究的方向之一。
　　 葫蘆素B(cucurbitacinB)是從葫蘆科植物中提取的一類高度氧化的四環(huán)三萜類化合物,研究表明它具有抗腫瘤、抗化學致癌和抗炎等多種生物活性。體內外研究表明,葫蘆素B能夠抑制腫瘤細胞增殖并誘導其凋亡,對于多種人類腫瘤細胞有較強的生長抑制作用。本實驗室對葫蘆素B的抗癌作

4、用也做了大量的研究,發(fā)現(xiàn)葫蘆素B在體內外對乳腺癌、喉癌、胰腺癌及肝癌都有很好的抑制作用。但是這些作用都是基于對葫蘆素B的抗增殖和誘導細胞凋亡等機制的研究,關于葫蘆素B的抗侵襲和轉移作用的研究還未見報道。本實驗主要致力于葫蘆素B對肝癌細胞侵襲和轉移是否有抑制作用及其機制的研究。
　　 材料和方法：
　　 肝癌細胞系HepG2和BEL7402傳代培養(yǎng)。MTT法檢測并計算葫蘆素B對肝癌細胞的增殖抑制率;不同濃度的葫蘆素B作用于

5、肝癌細胞系通過EMT和MET實驗,以及軟瓊脂克隆實驗觀察葫蘆素B對TPA作用后的肝癌細胞粘附作用的影響;通過劃痕實驗,transwell實驗觀察葫蘆素B對肝癌細胞侵襲轉移的抑制作用;通過明膠酶譜和westernblot檢測葫蘆素B對TPA誘導的肝癌細胞MMP-9表達的影響。通過westernblot方法檢測MAPK(ERK1/2,P38,JNK),Akt,NF-gB,C-Fos,C-Jun等蛋白的表達的影響,探討葫蘆素B抑制TPA誘導的

6、肝癌細胞MMP-9表達可能的作用機制。
　　 結果：
　　 1、不同濃度的葫蘆素B和TPA作用于HepG2和BEL7402細胞,MTT實驗結果顯示:200nMTPA和葫蘆素B在濃度低于1μM時,對兩種細胞系的增殖率影響很小。軟瓊脂克隆形成:TPA能促進HepG2細胞的克隆形成,葫蘆素B能顯著抑制TPA誘導的克隆形成。EMT結果顯示:TPA作用于貼壁后的HepG2細胞,顯微鏡下看到細胞形態(tài)變長,運動遷移能力增強,葫蘆素B能

7、抑制這種現(xiàn)象。MET結果顯示:TPA能促進細胞的粘附貼壁,而葫蘆素B能顯著抑制細胞的粘附貼壁。
　　 2、劃痕實驗和transwell顯示TPA能顯著促進兩種肝癌細胞的侵襲或轉移,葫蘆素B能抑制肝癌細胞的侵襲或轉移。
　　 3、明膠酶譜和westernblot結果表明TPA能誘導HepG2細胞MMP-9酶活性以及蛋白的表達,葫蘆素B能抑制MMP-9的酶活性和蛋白的表達。TPA作用與HepG2細胞后,p-ERK1/2,p-