美伐他汀對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力的抑制作用及其放化療增敏作用.pdf

1、肺癌已占據(jù)全球癌癥死亡的首位，發(fā)病率和病死率逐年上升，其中非小細(xì)胞肺癌fNSCLC)占肺癌總數(shù)的80％，其惡性度高，對(duì)放療、化療不敏感，5年生存率不足15％。研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤細(xì)胞對(duì)膽固醇及其前體物質(zhì)的濃度要求較高，所以限制膽固醇的合成和利用，可作為腫瘤預(yù)防和治療的輔助手段。美伐他汀(mevastatin，M)屬HMG-CoA還原酶抑制劑，是甲羥戊酸(mevalonate,MVA，系類(lèi)異戊二烯的前體)合成途徑的限速酶。另外，甲羥戊酸還是

2、除膽固醇外，長(zhǎng)醇、泛醌等多種生物合成類(lèi)異戊二烯化合物的前體。甲羥戊酸衍生物即類(lèi)異戊二烯類(lèi)化合物可以影響Ras和Rho。蛋白的細(xì)胞膜精確定位，它們構(gòu)成細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)并維持其完整性，并參與細(xì)胞的增殖、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和抑制腫瘤細(xì)胞侵襲等重要生物學(xué)功能。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)美伐他汀可抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞(如結(jié)腸癌細(xì)胞、HL-60 細(xì)胞)的增殖并誘導(dǎo)凋亡，并可以起到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，他汀類(lèi)藥物可以增強(qiáng)某些細(xì)胞毒藥物以及放療和化療的

3、抗腫瘤作用，而且并不影響正常組織的功能。迄今為止，他汀類(lèi)藥物這些作用的確切分子機(jī)制尚不完全清楚。本研究擬探討了美伐他汀對(duì)NSCLC增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力的抑制作用及其放化療增敏作用，旨在為美伐他汀的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，為NSCLC的治療提供新的思路。 本實(shí)驗(yàn)分為如下四個(gè)部分： 第一部分：美伐他汀對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞體外增殖的影響 目的：研究美伐他汀對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞體外增殖的影響和影響機(jī)制。 方法：1．四唑氮

4、藍(lán)比色試驗(yàn)(MTT)檢測(cè)美伐他汀對(duì)肺腺癌細(xì)胞株A549和肺鱗癌細(xì)胞株NCI-H520的體外增殖抑制作用。2．流式細(xì)胞儀檢測(cè)美伐他汀對(duì)NSCLC細(xì)胞周期影響。3．應(yīng)用RT-PCR 方法和流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)P21mRNA和蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：1．美伐他汀對(duì)肺腺癌細(xì)胞株A549和肺鱗癌細(xì)胞株NCI-H520均有明顯的體外增殖抑制作用，IC<,50>值均為50μmol/L，而且隨美伐他汀劑量的增大和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用明顯增強(qiáng)，即有明顯

5、的時(shí)間和劑量依賴(lài)關(guān)系。2.隨著美伐他汀作用劑量加大，細(xì)胞周期發(fā)生改變，G<,0>/G<,1>期細(xì)胞明顯增加，說(shuō)明美伐他汀可以引起NSCLC細(xì)胞周期阻滯。A549 和NCI-H1520細(xì)胞經(jīng)25-100 ummol/L 美伐他汀作用后，G<,0>/G<,1>細(xì)胞比例分別為44.46％、68.15％、71.16％和48.48％、70.24％、82.86％，明顯高于對(duì)照(P<0.05，P<0.01)。3加入外源性甲羥戊酸可完全逆轉(zhuǎn)美伐他汀對(duì)A

6、549和NCI-H520細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用和對(duì)其細(xì)胞周期的影響。4.美伐他汀作用后A549與NCI-H520細(xì)胞各組P21 mRNA的表達(dá)水平均無(wú)明顯變化；P21 胞膜蛋白進(jìn)行性下降(P<0.05，P<0.01)，成劑量依賴(lài)性；而P21總蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)。 結(jié)論：1.美伐他汀對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株有明顯的增殖抑制作用，且呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性。2.美伐他汀對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的抑制作用與其誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯有關(guān)。3.加

7、入外源性MVA可以完全消除美伐他汀對(duì)A549、NCI-H520細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期分布的影響，說(shuō)明美伐他汀對(duì)NSCLC 細(xì)胞增殖的抑制作用是通過(guò)抑制甲羥戊酸的合成介導(dǎo)的。4.美伐他汀通過(guò)影響ras蛋白的異戊二烯化，即P21蛋白的膜定位，達(dá)到抑制NSCLC細(xì)胞增殖的作用。 第二部分：美伐他汀對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡的影響 目的：研究美伐他汀對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡的影響和影響機(jī)制 方法：1.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)、丫啶橙雙色熒光

8、顯微鏡和電鏡分析檢測(cè)了美伐他汀對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡的影響，2.采用RT-PCR 技術(shù)分析了美伐他汀作用后凋亡相關(guān)因子X(jué)IAP、Survivin mRNA的表達(dá)3.采用western blot 技術(shù)分析了美伐他汀作用Survivin蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：1.丫啶橙雙色熒光染色顯示美伐他汀作用于A549和 NCI-H520細(xì)胞48小時(shí)，均出現(xiàn)不同程度的早期凋亡細(xì)胞和少量中晚期凋亡細(xì)胞(呈現(xiàn)橙色熒光，可見(jiàn)核的斷裂和濃縮)，而且隨美伐他

9、汀劑量的增大，改變?cè)矫黠@。其中晚期凋亡細(xì)胞百分率分別為8.17％、21.83％和29.53％和18.58％、21.67％和36.39％，凋亡率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。2.透射電鏡從形態(tài)學(xué)上證實(shí)美伐他汀作用NSCLC細(xì)胞后可以出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)改變：50μmol/L 美伐他汀處理A549 48h后，出現(xiàn)早期凋亡細(xì)胞的形態(tài)的改變。 細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡變性，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，有出芽現(xiàn)象。100μmol/L 美伐他汀處理A549和NCI-H

10、520細(xì)胞48h后出現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞，表現(xiàn)為外形不規(guī)則，體積明顯縮小，胞漿濃縮，核碎裂，染色質(zhì)邊緣化、染色質(zhì)濃集。3．流式細(xì)胞儀檢測(cè)25-100μmol/L 美伐他汀作用于A549和NCI-H520 細(xì)胞后其凋亡率明顯增高(P<0.05)，呈劑量依賴(lài)性。加入外源性甲羥戊酸后A549和NCI-H520 細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較結(jié)果均無(wú)顯著性差異。 4．細(xì)胞周期的改變：細(xì)胞周期檢測(cè)亞G<,1>峰發(fā)現(xiàn)：隨著美伐他汀作用劑量加大A549和NCI-

11、H520 細(xì)胞亞Gl峰越來(lái)越明顯。5．50-100μmol/L 美伐他汀作用48小時(shí)后，NSCLC細(xì)胞的survivin mRNA及蛋白的表達(dá)逐漸降低，呈劑量依賴(lài)性。6．25-100μmol/L美伐他汀作用24小時(shí)后，NSCLC細(xì)胞的XIAP mRNA的表達(dá)逐漸降低，成劑量依賴(lài)性。 結(jié)論：1．美伐他汀作用NSCLC細(xì)胞后可以出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)及流式細(xì)胞學(xué)變化，即美伐他汀可以誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞發(fā)生凋亡。2．美伐他汀誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞

12、凋亡的機(jī)制可能與降低XIAP、survivin的表達(dá)有關(guān)。3．加入外源性MVA可以完全消除美伐他汀對(duì)A549、NCI-H520細(xì)胞凋亡的影響，說(shuō)明美伐他汀誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡的機(jī)制是通過(guò)抑制甲羥戊酸的合成介導(dǎo)的。 第三部分：美伐他汀對(duì)NSCLC細(xì)胞體外粘附能力和侵襲力的影響 目的：研究美伐他汀對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞體外粘附能力和侵襲力的影響 方法：1 應(yīng)用粘附試驗(yàn)、Transwell法檢測(cè)美伐他汀對(duì)NSCLC 細(xì)胞

13、株的體外粘附和侵襲能力的影響。2 應(yīng)用western blot 方法檢測(cè)MNIP和NF-kB蛋白的表達(dá)探討美伐他汀影響NSCLC細(xì)胞株粘附和侵襲能力的機(jī)制。 結(jié)論：1．美伐他汀可降低NSCLC細(xì)胞的體外粘附能力。2．美伐他汀可以抑制NSCLC細(xì)胞的體外侵襲能力，3．美伐他汀抑制 NSCLC 細(xì)胞的粘附和體外侵襲能力，其機(jī)制可能與減少M(fèi)MP-9、MMP-2、NF-kB P65蛋白表達(dá)有關(guān)。 第四部分美伐他汀對(duì)非小細(xì)胞肺癌的

14、放療和化療的增敏作用及機(jī)制 目的：探討美伐他汀對(duì)NSCLC的放療和化療增敏作用及其機(jī)制。 方法：1．MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)放療、順鉑(DDP)、足葉乙甙(VP16)單獨(dú)應(yīng)用的增殖抑制率及與美伐他汀聯(lián)合應(yīng)用的增殖抑制率，并根據(jù)金氏公式計(jì)算 Q 值，評(píng)價(jià)兩藥的合用效應(yīng)，檢測(cè)了美伐他汀對(duì)NSCLC的放療和化療的影響，2．應(yīng)用Western印跡法檢測(cè)p53蛋白在其中發(fā)揮的作用，探討美伐他汀對(duì)NSCLC放療和化療增敏的作用機(jī)制。